(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210749585.1 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 柳州市人民医院 地址 545006 广西壮 族自治区柳州市城中 区文昌路8号 (72)发明人 唐石伏　邢利　任明君　闭婉英　 王万平　龙涌文　 (74)专利代理 机构 南宁新途专利代理事务所 (普通合伙) 45119 专利代理师 覃晓捷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状RNA标志物 的应用及诊断试剂盒 (57)摘要 本发明属于分子生物学与生物医药技术领 域， 提供两种快速鉴别早期鼻咽癌的环状RNA标 志物的应用及诊断试剂盒， 具体是环 状RNA hsa_ circ_0006220和/或hsa_circ_0001666作为诊断 标志物在制备快速鉴别早期鼻咽癌的产品中的 应用。 对于环状RNA  hsa_circ_0006220的应用， 试剂盒中含有定量检测hsa_cir c_0006220的PCR 引物对， 对于环 状RNAhsa_circ_0001666的应用， 试剂盒中含有定量检测hsa_cir c_0001666的PCR 引物对。 本发明中的标志物特异性好、 重复性好、 可以准确、 快速、 高通量地运用于早期鼻咽癌的 筛查， 为快速临床诊断提供依据。 权利要求书2页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 115074442 A 2022.09.20 CN 115074442 A 1.环状RNA  hsa_circ_0006220和/或hsa_circ_0001666作为诊断标志物在制备快速鉴 别早期鼻咽癌的产品中的应用， 所述环状RNA  hsa_circ_0006220具有如SEQ  ID NO： 1所示 的序列， 所述环状hsa_circ_0 001666具有如SEQ  ID NO： 2所示的序列。 2.根据权利要求1所述应用， 其特征在于： 对于环状RNA  hsa_circ_0006220的应用， 所 述的产品中含有定量检测hsa_circ_0006220的PCR引物对和内参基因β ‑Actin特异性引物， 所述PCR引物对中， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示： TCTGTTTGCATCTACCCTGCT， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示： CACACTCCTCCTTGGTCTTGG； 所述内参基因β ‑ Actin引物对中， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示： TCACCAA CTGGGACGACATG， 下游 引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 6所示： GTCAC CGGAGTCCATCACGAT。 3.根据权利要求1所述应用， 其特征在于： 对于环状RNAhsa_circ_0001666的应用， 所述 的产品中含有定量检测hsa_circ_0001666的PCR引物对和内参基因β ‑Actin特异性引物， 所 述PCR引物对中， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 7所示： CTGCCTAGCTGTCAAGGAGTGG， 下 游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8所示： TCCGGGAAAGGATCTGGAATG； 所述内参基因β ‑Actin 引物对中， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示： TCACCAACTGGGACGACATG， 下游引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 6所示： GTCAC CGGAGTCCATCACGAT。 4.根据权利要求1所述应用， 其特征在于： 所述的产品包括试剂、 试纸、 试剂盒或基因芯 片。 5.根据权利要求2或3所述应用， 其特征在于： 所述定量检测hsa_circ_0006220或hsa_ circ_0001666的方法包括以下步骤： 1)从待测血清样品中提取RNA， 得到RNA样品； 2)向提取出的RNA样品先去除基因组DNA反应， 然后加入反转录酶， 将RNA逆转录成 cDNA； 3)向步骤2)所得cDNA中加入PCR引物对F/R和饱和荧光染料， β ‑Actin为内参基因， 在特 定条件下进行PCR扩增反应， 得到扩增产物； 4)对步骤3)所得扩增产物， 通过熔解曲线分析确定扩增产物的特性， 排除引物二聚体， 每个样本设置3个复孔， 设置固定阈值记录Ct值， 取3次PCR结果计算平均Ct值， 采用相对定 量法计算各样本的表达水平。 6.根据权利要求5所述应用， 其特征在于： 所述步骤2)中逆转录体系如下： PrimeScript   RT Enzyme Mix I 1.0μl， RT  Primer Mix 1.0μl， 5×PrimeScript  Buffer 2for Real  Time 4.0 μl， RNase  Free dH2O 4.0 μl； 逆转录反应程序为： 37℃15mi n， 85℃5sec 。 7.根据权利要求5所述应用， 其特征在于： 所述步骤3)中PCR扩增反应体系如下： TB   Geen Premix Ex TaqTMⅡ(Ti RNaseH Plus)10 μl,cDNA模板2 μl， 10 μM上下游引物各0.8 μl， ddH2O 6 μl,ROX 0.4 μl； PCR扩增反应的程序为： 95℃预变性30sec,95℃5sec,60℃34sec,共 40个循环， 在6 0℃时采集 荧光信号。 8.快速鉴定早期鼻咽癌的试剂盒， 其特征在于： 所述的试剂盒中含有定量检测hsa_ circ_0006220的PCR引物对和/或定量检测hsa_circ_0 001666的PCR引物对。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于： 所述定量检测hsa_circ_0006220的PCR 引物对中， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示： TCTGTTTGCATCTA CCCTGCT， 下游引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示： CACACTC CTCCTTGGTCTTGG。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115074442 A 210.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于： 所述定量检测hsa_circ_0001666的PCR 引物对中， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 7所示： CTGCCTAGCTGTCAAGGAGTGG， 下游引 物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8所示： TC CGGGAAAGGATCTGGAATG。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115074442 A 3