(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210588934.6 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 浙江海洋大学 地址 316000 浙江省舟山市定海区临城街 道海大南路1号 (72)发明人 祁鹏志　朱莉　严小军　郭宝英　 (74)专利代理 机构 北京卓胜佰达知识产权代理 有限公司 16 026 专利代理师 陈桂兰 (51)Int.Cl. C07K 14/825(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 两种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因在 海域重金属污染监测中的应用 (57)摘要 本发明提供了两种厚壳贻贝金属硫蛋白及 其编码基因及其在监测海域重金属污染中的应 用， 属于功能基因技术领域。 本发明鉴定得到厚 壳贻贝金属硫蛋白基因McMT ‑10和McMT ‑20。 以这 两种基因序列为模板设计了两对高特异性荧光 定量PCR引物用以检测其在重金属污染环 境中的 表达量变化。 结果显示McMT ‑10和McMT ‑20对重金 属污染高度敏感， 根据其表达量的变化可以检测 低剂量的重金属污染， 同时可以反应污染的严重 程度。 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图1页 CN 114920829 A 2022.08.19 CN 114920829 A 1.两种厚壳贻贝金属硫蛋白， 其特征在于， 包括McMT ‑10和McMT ‑20； 所述McMT ‑10的氨 基酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述McMT‑20的氨基酸序列如SEQ  ID NO:2所示。 2.一种编码权利要求1所述厚壳贻贝金属硫蛋白的基因， 其特征在于， 包括McMT ‑10和 McMT‑20； 所述McMT ‑10的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述McMT ‑20的核苷酸序列如SEQ   ID NO:4所示。 3.一种权利要求2所述基因的扩增引物， 其特征在于， 包括McMT ‑10扩增引物和McMT ‑20 扩增引物； 所述McMT ‑10扩增引物包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列 如SEQ ID NO:6所示的反向引物； 所述McMT ‑20扩增引物包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列 如SEQ ID NO:8所示的反向引物。 4.一种监控海洋重金属污染的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求3所述扩 增引物、 内参引物和荧 光定量PCR检测扩增试剂； 所述内参引物包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示的GAPDH基因正向引 物和核苷酸序 列如SEQ ID NO:10所示的GAP DH基因反向引物。 5.根据权利要求 4所述试剂盒， 其特 征在于， 所述扩增试剂还 包括反转录试剂。 6.权利要求1所述厚壳贻贝金属硫蛋白、 权利要求2所述基因、 权利要求3所述引物或权 利要求4或5所述试剂盒在监测海域重金属污染中的应用。 7.根据权利要求6所述应用， 其特征在于， 所述重金属包括以下一种或几种： 铜、 锌和 镉。 8.一种监控 海洋重金属污染的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)采集海岸线厚壳贻贝， 提取厚壳贻贝的RNA； 2)以步骤1)中所述RNA为模板进行反转录， 得到 cDNA； 3)以步骤2 )中所述cDNA为模板， 用权利要求3所述引物进行荧光定量PCR扩增， 分析 McMT‑10和/或McMT ‑20表达水平相对于对照组的变化趋势， McMT ‑20显著上调而McMT ‑10表 达量无明显变化时， 表 示海域受到重金属污染， 但污染程度较轻； 所述McMT ‑20和McMT ‑10表 达量均显著上调时表示重金属污染程度较重 。 9.根据权利要求8所述监控海洋重金属污染的方法， 其特征在于， 所述污染程度较轻是 铜、 铅和镉的浓度依次低于10.0、 5.0和5.0 μg/L； 所述重金属污染程度较重是铜、 铅和镉浓度依次高于 50.0、 20.0和20.0 μg/L。 10.根据权利要求8 或9所述监控海洋重金属污染的方法， 其特征在于， 所述重金属包括 以下一种或几种： 铜、 锌和镉。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114920829 A 2两种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因在海域重金属污染 监 测中的应用 技术领域 [0001]本发明属于功能基因技术领域， 具体涉及两种厚壳贻贝金属硫蛋白及 其编码基 因 及其在监测海域重金属污染中的应用。 背景技术 [0002]世界工业化进程的加快不可避免导致重金属的排放， 并通过地下水汇集入河流 中， 最终流入 海洋。 近岸海域重金属污染是当前全世界沿海国家所面临的普遍性环境问题。 [0003]目前， 重金属污染检测的常用方法是采集水样， 然后通过生化方法如原子吸收分 光光度法对其中的重金属元素如铜、 锌、 镉等进行鉴定。 此方法程序繁琐、 工作量大且反应 迟钝， 往往只有污染程度较高时才能予以检测到， 缺乏时效性。 利用海洋指示生物中表达的 蛋白作为生物标志物进行重金属污染的监控是近年来世界沿海国家普遍兴起的监控方法， 能在一定程度反 映出环境污染的综合生物学效应， 是环境监测行之有效的手段之一。 然而 我国拥有绵长的海岸线， 选择一种标准的海洋指示生物及其能够表达准确指示重金属污染 的蛋白标志 物是一种亟 待解决的问题。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因， 其表 达水平对重金属污染高度敏感， 能够用于准确监测海域重金属污染中。 [0005]本发明提供了一种厚壳贻贝金属硫蛋白， 包括McMT ‑10和McMT ‑20； 所述McMT ‑10的 氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示； [0006]所述McMT‑20的氨基酸序列如SEQ  ID NO:2所示。 [0007]本发明提供了一种编码所述厚壳贻贝金属硫蛋白的基因， 包括McMT ‑10和McMT ‑ 20； 所述McMT ‑10的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述McMT ‑20的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:4所示。 [0008]本发明提供了一种所述基因的扩增引物， 包括McMT ‑10扩增引物和McMT ‑20扩增引 物； [0009]所述McMT ‑10扩增引物包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示的正向引物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO:6所示的反向引物； [0010]所述McMT ‑20扩增引物包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示的正向引物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO:8所示的反向引物。 [0011]本发明提供了一种监控海洋重金属污染的试剂盒， 所述试剂盒包括所述扩增引 物、 内参引物和荧 光定量PCR检测扩增试剂； [0012]所述内参引物包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示的GAPDH基因正向引物和核苷 酸序列如SEQ  ID NO:10所示的GAP DH基因反向引物。 [0013]优选的， 所述扩增试剂还 包括反转录试剂。说　明　书 1/4 页 3 CN 114920829 A 3