(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210615651.6 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 (72)发明人 吴磊　张旭　何漪　姜朋　张鹏　 李畅　 (74)专利代理 机构 江苏圣典律师事务所 32 237 专利代理师 杨文晰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与小麦籽粒DON毒素积累相关的分子标记及 其引物与应用 (57)摘要 本发明公开了一种 与小麦籽粒DON毒素积累 相关的分子标记及其应用， 该分子标记是以普通 小麦基因组DNA为模板， 核苷酸序列分别如SEQ   ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的引物对进行PCR扩 增， 在1％的琼脂糖凝胶上电泳后获得结果， 扩增 产物大小 为214bp； 该分子标记扩增时间短、 效率 高， 可以应用于小麦群体的基因型分析和抗籽粒 毒素积累位 点的遗传作图。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图3页 CN 115044697 A 2022.09.13 CN 115044697 A 1.一种与小麦籽粒DON毒素积累相关的分子标记， 其特征在于， 所述分子标记是通过如 下方法获得的： 以安农8455的DNA为模板， 以核苷酸序列分别如SEQ  IDNO.1和SEQ  ID NO.2 所示的序列为引物进行PCR扩增后电泳， 所获得的大小为214bp的DNA片段。 2.如权利要求1所述分子标记在筛选低DON毒素积累量的小麦种质中的应用， 即含有所 述分子标记的小麦品种DON毒素积累量高于不含所述分子标记的小麦品种。 3.如权利要求1所述分子标记在绘制小麦 籽粒毒素积累位 点的遗传图谱中的应用。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述应用是指， 以样品小麦DNA为模板,以 核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2为引物进行PCR扩增后电泳， 若电泳产物存 在大小为214bp的DNA片段,则判定该样品含有分子标记JAASM3424； 反之， 则 不含分子标记 JAASM3424； 判 定含有分子标记JAASM3424的小麦品种DON毒素积累量高于不含该分子标记 JAASM3424的小麦品种。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 所述PCR扩增是指： PCR扩增体系： 10 × buffer 1µl， 浓度为25mM的MgCl2溶液0.5  µl, 浓度为2.5mM的dNTP 溶液 0.5  µl， 浓度为10 µM的引物I  0.5  µl， 浓度为10 µM的引物II  0.5  µl， 浓度为5U/ µl的 Taq聚合酶  0.2  µl， 模板 DNA 50 ng， ddH2O补足至 10  µl;所述引物I的核苷酸序列如SEQ   ID NO.1所示， 所述引物I I的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； PCR扩增程序： 94 ˚C 3分钟； 94 ˚C 10秒， 60˚C 30秒， 72˚C 10秒延伸， 30个循环； 72 ˚C延 伸5分钟。 6.一对用于预测小麦籽粒DON毒素积累量的引物对， 该引物对的核苷酸序列分别如SEQ   ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044697 A 2与小麦籽粒DON毒素积 累相关的分子标记及其引物 与应用 技术领域 [0001]本发明属于小麦遗传育种和分子生物学领域， 特别是一种与小麦籽粒毒素积累相 关的分子标记及其应用。 背景技术 [0002]小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌(Fusarium  graminearum)引起的重要真菌病害， 严重 影响小麦的产量和品质。 在一般流行年份， 赤霉病可引起5 ‑10％的产量损失， 大流行年份可 导致部分田块绝收， 危害小麦粮食安全。 禾谷镰刀菌分泌的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol,DON)是一种细胞毒素， 被列为3类致癌物， 可引起免疫抑制或免疫刺激反 应。 DON毒素在小麦籽粒中的积累对人类及牲畜的的健康构成了威胁， 食用被DON毒素的食 物后会出现厌食、 呕吐和腹泻等急性中毒症状， 严重时可导致循环系统损伤而死亡。 根据食 品安全国家标准GB2761 ‑2017中对食品中真菌毒素的限量要求， 谷物及其制品如玉米(面、 渣)、 大麦、 小麦、 麦片和小麦粉中的DON毒素含量 不得超过1mg/kg。 [0003]小麦赤霉病抗性可以分为5种类型： Ⅰ， 抗侵染； Ⅱ,抗扩展； Ⅲ,抗籽粒毒素积累； Ⅳ,抗籽粒侵染；Ⅴ,耐病性(M esterházy 1995； Mesterházy et al.1999)。 耐毒素积累抗性 特指毒素在小麦籽粒内被降解或产毒被抑制造成的毒 素积累减少， 具有不同于其他抗性类 型的遗传机制。 Sz abó‑Hevér等在小麦 “Frontana ”3A， 4B， 7A和7B染色体上检测到抗籽粒毒 素积累位点， 解释3.1 ‑11.1％的表型变异(Sz abó‑Hevér et al.,2014)。 通过遗传作图， 在 7A染色体上检测到一个稳定的QTL位点， 可以解释16 ‑24％的表型变异(He  et al.,2019)。 在挪威小麦品种 “NK93604”的2AS染色体上检测到一个与抗籽粒毒素积累位点， 可以解释 26.7％的表型变异， 但只在一个环境中可以被检出(Semagn  et al.,2007)。 此外， 在 “望水 白”的1A,1BL， 3BS， 5AS， 5DL和7A染色体(Yu  et al.2008)， “Ernie”的4DS和6AL染色体(Liu   et al.,2013)， “Wuhan‑1”的2DS和5AS染色体(Somers  et al.,2003)， “SHA3/CBRD ”的1A, 2A,2D,3AS,5BL,5A和6A染色体(Lu  et al.,2012)上也检测出微效的QTL位点。 利用全基因 组关联分析在美国和国际小麦和玉米改良中心(CIMMYT)群体里也检测出与 耐毒素积累的 位点， 这些位点分布在3B， 1D， 2B， 3A， 2BL染色体上,解释3 ‑12％的表型变异(Arruda  et  al.,2016； Wang  et al.,2017)。 上述位点的标记的开发基于单核苷 酸多态性 或简单重复序 列多态性， 难以直接利用， 或 需要繁琐的分型步骤， 不适合大规模的种质筛选或分子标记辅 助选择。 [0004]此外， 利用小麦籽粒毒素积累相关的分子标记对遗传群体进行分型， 在绘制遗传 图谱的基础上， 精细定位中国小麦品种 “苏麦3号”的抗籽粒毒素积累位点是小麦抗赤霉病 遗传改良的重要步骤。 常用的高通量分型方法基于基因组单核苷酸多态性， 分型芯片的设 计和制造依赖 于进口， 分型成本较高， 难以形成大规模的研发定位。 发明内容 [0005]针对上述问题， 本发明通过全基因组关联分析和物理位置比对获得了一个新的与说　明　书 1/6 页 3 CN 115044697 A 3