(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210743474.X (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 浙江省农业科 学院 地址 310021 浙江省杭州市德胜中路2 98号 (72)发明人 魏庆镇　王五宏　包崇来　胡天华　 胡海娇　汪精磊　严亚琴　 (74)专利代理 机构 杭州星隆专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33441 专利代理师 刘星海 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与不结球白菜开花早晚紧密连锁的Indel分 子标记及应用 (57)摘要 本发明涉及分子遗传育种技术领域， 具体公 开了一种与不结球白菜开花早晚紧密连锁的 Indel分子标记及应用， 所述Indel 分子标记基于 不结球白菜7号染色体BrFT基因启动子区域， 所 述BrFT基因启动子区域的部分核苷酸序列如SEQ   ID NO： 1所示。 本发明具有对不结球白菜开花时 间性状的早期鉴定及筛选的准确性和可靠性均 较好的特点。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 115261501 A 2022.11.01 CN 115261501 A 1.与不结球白菜开花早晚紧密连锁的Indel分子标记， 其特征是： 所述Indel分子标记 基于不结球白菜7号染色体BrFT基因启动子区域， 所述BrFT基因启动子区域的部分核苷酸 序列如SEQ  ID NO： 1所示。 2.用于获得权利要求1所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁的Indel分子标记的特 异性引物对。 3.根据权利要求2所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁 的Indel分子标记的特异性 引物对， 其特 征是： 所述引物对的核苷酸序列为， 正向引物， F ‑GCCGGGTACTTGACCCGTGC， 如SEQ  ID NO： 2所示； 反向引物， R ‑CGAGTCAATTCACCCCGCGC； 如SEQ  ID NO： 3所示。 4.与不结球白菜开花早晚紧密连锁的Indel分子标记在实现不结球白菜开花时间性状 的早期鉴定和筛 选中的应用。 5.根据权利要求4所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁 的Indel分子标记在实现不 结球白菜开 花时间性状的早期鉴定和筛 选中的应用， 其特 征是： 包括以下步骤， (S11)选取晚开花的不结球白菜品种A和早开花的不结球白菜品种B作为两个亲本， 利 用两个亲本的DNA， 对BrFT基因包 含上游启动子区域进行扩增、 测序和拼接； (S12)对步骤(S11)中所获得的两个亲本 的BrFT基因及其启动子区域进行序列比对分 析， 使用引物设计软件， 针对启动子区域差异， 设计与不结球白菜开花早晚紧密连锁的 Indel分子标记的引物； (S13)对步骤(S12)中与不结球白菜开花早晚紧密连锁的Indel分子标记的引物， 利用 亲本DNA进行PCR扩增， 根据目标扩增片段在亲本中存在的差异， 获得与不结球白菜开花早 晚紧密连锁的I ndel分子标记。 6.根据权利要求5所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁 的Indel分子标记在实现不 结球白菜开花时间性状的早期鉴定和筛选中的应用， 其特征是： 所述BrFT基因的获得包括 以下步骤， (S04)分别提取极端早开花F2代单株、 极端晚开花F2代单株和两个不结球白菜亲本的 DNA； (S05)分别测定步骤(S04)中极端早开花F2代单株DNA和极端晚开花F2代单株DNA的浓度 值； (S06)根据步骤(S05)中测得的DNA浓度值进行DNA等量混池后， 分别构建早开花E池和 晚开花L池； (S07)分别对步骤(S06)中E池和L池以及两个亲本的DNA进行高深度重测序， 利用青菜 参考基因组， 分别得 出SNP‑index(极端性状E)值和SNP ‑index(极端性状L)值； (S08)根据公式 △(SNP‑index)＝SNP ‑index(极端性状L) ‑SNP‑index(极端性状E)， 计 算得出△(SNP‑index)值； (S09)选取99％置信水平作为筛选阈值， 根据 △(SNP‑index)值， 得出与不结球白菜开 花早晚相关的主效QTL 位点位于不结球白菜第7号染色体的21.1Mb ‑25.25Mb区域内； (S10)在与不结球白菜开花早晚相关的主效QTL位点内， 利用拟南芥开花相关基因 AT1G65480比对查找， 同时结合 △(SNP‑index)数值， 划定QTL位点峰值对应的峰值区域， 在 峰值区域内得 出拟南芥开 花相关基因AT1G6 5480的同源基因BrFT。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261501 A 27.根据权利要求6所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁 的Indel分子标记在实现不 结球白菜开花时间性状 的早期鉴定和筛选中的应用， 其特征是： 所述极端早开花F2代单株 和极端晚开 花F2代单株的获得包括以下步骤， (S01)选取晚开花的不结球白菜品种A和早开花的不结球白菜品种B杂交， 得不结球白 菜F1代； (S02)将步骤(S01)中的不结球白菜F1代自交得不结球白菜F2代， 并统计不结球白菜F2 代的单株开 花时间； (S03)根据步骤(S02)中不结球白菜F2代的单株开花时间， 选取获得极端早开花F2代单 株和极端晚开 花F2代单株。 8.根据权利要求6所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁 的Indel分子标记在实现不 结球白菜开 花时间性状的早期鉴定和筛 选中的应用， 其特 征是： 还包括步骤， (S14)利用Indel分子标记引物分别将极端早开花F2代单株DNA、 极端晚开花F2代单株 DNA进行扩增， 并将扩增产物置 于琼脂糖凝胶上进行电泳， 并对电泳结果进行比对。 9.根据权利要求5所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁 的Indel分子标记在实现不 结球白菜开花时间性状的早期鉴定和筛选中的应用， 其特征是： 所述PCR扩增 体系为， 正向 引物1μL， 反向引物1μL， 不结球白菜亲本DNA50 μg， Rapid  Taq Master Mix12 μL， ddH2O补至 25 μL。 10.根据权利要求5所述的与不结球白菜开花早晚紧密连锁的Indel分子标记在实现不 结球白菜开花时间性状的早期鉴定和 筛选中的应用， 其特征是： 所述PCR扩增的程序为， 95 ℃预变性3min； 95℃变性15s， 55℃退火15s， 72℃延伸30s， 38个循环； 72℃延伸10min； 保存 温度4℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261501 A 3