(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210607557.6 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 陕西脉元生物科技有限公司 地址 710311 陕西省西安市高新区草堂科 技产业基地秦岭大道西2号科技企业 加速器园区1期八号楼1- 3-2.1-2-2 (72)发明人 李科　闫亚平　程静美　郝文斌　 赵子越　封雪　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C07K 14/705(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的 NMDAR突变 体及其构建方法 (57)摘要 本发明提供了与NMDAR脑炎患者中的自身抗 体结合的NMDAR突变体及其构建方法， 涉及生物 医药技术领域。 本发明所述NMDAR的突变体可与 抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合， 从而为利 用通用型CAR ‑T疗法治疗抗NMDAR抗体脑炎提供 了多种不同种类的抗原肽。 本发明对于NMDAR的1 α亚基进行突变， 缺失胞内段3或跨膜段4， 或胞 内段3或与膜段4同时缺失， 突变体与患者样本中 的自身抗体结合不受影 响； 缺失胞内段5时， 突变 体与患者样 本中的自身抗体结合信号减弱。 其余 不同段的多个氨基酸缺失均会影响患者样本中 自身抗体的结合。 权利要求书2页 说明书10页 序列表16页 附图1页 CN 114957446 A 2022.08.30 CN 114957446 A 1.与NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合的NMDAR突变体， 所述NMDAR突变体包括： NMDAR1 α 亚基缺失胞外段1 中不多于2个氨基酸、 缺失跨膜段4、 缺失胞内段3、 缺失胞内段5中不多于 5个连续氨基酸、 缺 失胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸和/或缺 失跨膜段6与胞外段7的连 接处氨基酸； 所述胞外段1位于SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的19 ‑559位； 所述跨膜段4位于SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的6 03‑624位； 所述胞内段3位于SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的581 ‑602位； 所述胞内段5位于SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的625 ‑630位； 所述胞外段1与跨膜段2的连接处氨基酸位于SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的559 ‑560 位； 所述跨膜段6与胞外段7的连接处氨基酸位于SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的647 ‑648 位。 2.根据权利要求1所述的NMDAR突变体， 其特征在于， 所述NMDAR突变体包括： 缺失胞内 段3或跨膜段4， 或胞内段3与跨膜段4同时缺失。 3.根据权利要求1或2所述的NMDAR突变体， 其特征在于， 所述跨膜段2位于SEQ  ID NO.2 所示氨基酸序列的5 60‑580位； 所述跨膜段6位于SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的6 31‑647位； 所述胞外段 7位于SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的648 ‑812位。 4.构建权利 要求1～3任一项所述的NMDAR突变体的引物对， 其特征在于， 包括针对胞外 段1设计的引物19 ‑559‑F和19‑559‑R， 针对跨膜段4设计的引物603 ‑624‑F和603‑624‑R， 针 对胞内段3设计的引物581 ‑602‑F和581‑602‑R， 针对胞内段5设计的引物625 ‑630‑F和625‑ 630‑R， 针对胞外段1与跨膜段2的连接处氨 基酸设计的引物559 ‑560‑F和559‑560‑R， 和针对 跨膜段6与胞外段 7的连接处氨基酸设计的引物647 ‑648‑F和647‑648‑R； 所述19‑559‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述19 ‑559‑R的核苷酸序列如SEQ   ID NO.4所示； 所述603‑624‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 所述603 ‑624‑R的核苷酸序列如SEQ   ID NO.6所示； 所述581‑602‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示， 所述581 ‑602‑R的核苷酸序列如SEQ   ID NO.8所示； 所述625‑630‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示， 所述625 ‑630‑R的核苷酸序列如SEQ   ID NO.10所示； 所述559‑560‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.11所示， 所述559 ‑560‑R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.12所示； 所述647‑648‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示， 所述647 ‑648‑R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.14所示。 5.扩增权利 要求1～3任一项所述的NMDAR突变体的编码基因的方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 将编码SEQ  ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸插入pCDNA3.1中， 得模板质粒； 将 所述模板质粒和权利要求 4所述引物对混合进行PCR扩增。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 所述核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114957446 A 27.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的程序包括： 98℃预变性 2min； 98℃变性15s， 59℃退火15s， 72℃延伸4mi n， 30～35个循环； 72℃再延伸5～10mi n。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114957446 A 3