(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221070280 6.X (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 广西壮族自治区动物疫病预防控制 中心 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区友爱北路51号 (72)发明人 施开创　冯淑萍　莫胜兰　周庆安　 龙凤　尹彦文　韦海娜　赵康　 胡丽萍　 (74)专利代理 机构 南宁深之意专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 45123 专利代理师 张珣 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 不同基因缺失型ASFV的多重qPCR试剂盒及 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种针对缺失MGF505 ‑2R基 因、 EP402R基因或I177L基因等不 同基因缺失型 的非洲猪瘟病毒的多重qPCR试剂盒及检测方法； 所述试剂盒包括如序列表中SEQ  ID NO.1～SEQ   ID NO.12所述的引物和探针。 所述的检测方法是 采用上述试剂盒的多重qPCR检测方法， 其是将猪 组织样品、 全血或者环境拭子等样本进行总DNA 提取， 然后进行qPCR检测分析， 确定并区分不同 基因缺失型的非洲猪瘟毒株。 本发 明方法具有特 异性好、 灵敏度高的优点， 能够同时检测野生型 以及缺失MGF505 ‑2R基因、 EP402R基因或I177L基 因的ASFV毒株， 为实验室检测区分上述病毒株提 供了有效的技 术手段。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图7页 CN 115094164 A 2022.09.23 CN 115094164 A 1.不同基因缺失型ASFV的多重 qPCR试剂盒， 其特征在于： 包括相对应的引物组合F1、 R1 和探针A， 引物组合F2、 R2和探针B， 引物组合F3、 R3和探针C， 引物组合F4、 R4和探针D； 所述引物组合A包括以下引物： 引物F1： G GCGTATAAAAAGTCCAGGAAATTC； 引物R1： TTCGGCGAGCGCT TTATC； 所述探针A为： FAM ‑TCACCAAATCCTTTTGCGATGCA AGCT‑BHQ1； 所述引物组合B包括以下引物： 引物F2： AGTCATGCACG GCATATACA A； 引物R2： G GTTTAAACCGTGCCACATCC； 所述探针B为： VIC ‑ACGCGGCCACCCAATTCAGAGAC ‑BHQ1； 所述引物组合C包括以下引物： 引物F3： TACTACATGCGTC CCTCAACAC； 引物R3： A ATGGCGGGATATTGGGTAGT； 所述探针C为： C Y5‑ACCGTGTCCTCCACCCAAACCAT‑BHQ2； 所述引物组合D包括以下引物： 引物F4： G GCATAATTATCAAATGCGAAGGG； 引物R4： TG GAAAGTTAATGATCAG GGCTT； 所述探针D为： Texas  Red‑AATCCTAGCTTGCCGGTAATGGCT‑BHQ2。 2.不同基因缺失型ASFV的检测方法， 其特征在于： 所述检测方法是采用如权利要求1所 述的试剂盒的多重qPCR检测方法， 其包括以下步骤： （1） 样品处理： 采用DNA提取试剂盒对待测 样品进行总DNA的提取； 所述待测样品包括但 不限于环境拭子、 猪的 口咽拭子和鼻咽拭子、 猪的血 液、 肾脏、 脾脏和淋巴结的组织样品； （2） 扩增反应液配制： 将步骤 （1） 中得到的总DNA作为模板进行qPCR扩增反应， 采用如 SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液， 所述扩增反应液总 体积为20 μL， 其包括： 10 µL的Premix  Ex Taq ， 2.0µL的模板， 浓度为2 0 pmol/ μL的引物F 1和引物R1各0.2 µL， 0.2 μL的浓度为2 0 pmol/ μL的探针A， 浓度为2 0 pmol/ μL的引物F2和引物R2各0.2 µL， 0.3 μL的浓度为2 0 pmol/ μL的探针B， 浓度为2 0 pmol/ μL的引物F3和引物R3 各0.2µL， 0.2 μL的浓 度为20 pmol/ μL的探针C， 浓度为2 0 pmol/ μL的引物F4和引物R4各0.1 µL， 0.1 μL的浓度为2 0  pmol/ μL的探针D， 余 量为无核酸酶水； （3） qPCR扩增： 将步骤 （2） 中配制得到的扩增 反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下 扩增反应程序： Step1： 95℃预变性10s； Step2： 95℃变性5s， 5 6℃退火3 0s， 共进行40个 循环， 同时收集 荧光信号； （4） 结果检测： 通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结 果判定。 3.根据权利 要求2所述的不同基因缺失型ASFV的检测方法， 其特征在于： 在步骤 （1） 中， 所述待测样品为猪的血液、 肾脏、 脾脏和淋巴结中的任意一种或多种组织样品时， 将采集猪 的肾脏、 脾脏和淋巴结的组织样品加入搅拌器中， 再加入磷酸盐缓冲溶液进行均质化， 然后 用小钢珠摇动5分钟， 接着将均质化的样品冻融3次， 接着在4℃  下以10， 000 ×g 离心10分权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115094164 A 2钟， 然后取 上清液进行总DNA的提取， 提取 得到的总DNA置 于‑70℃下保存备用。 4.根据权利 要求2所述的不同基因缺失型ASFV的检测方法， 其特征在于： 在步骤 （4） 中， 当所得到的Ct值小于等于 35个循环时， 判定为阳性， 当Ct值大于 35个循环时， 判定为阴性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115094164 A 3