(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210734367.0 (22)申请日 2022.06.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114807453 A (43)申请公布日 2022.07.29 (73)专利权人 北京市疾病预防控制中心 地址 100013 北京市东城区和平里中街16 号 (72)发明人 崔淑娟　赵佳琛　刘医萌　彭晓旻　 卢桂兰　石伟先　潘阳　张代涛　 杨鹏　王全意　 (74)专利代理 机构 北京中知星原知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11868 专利代理师 王维佳　艾变开 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12R 1/93(2006.01) (56)对比文件 CN 113584223 A,2021.1 1.02 CN 114350854 A,202 2.04.15 CN 110387405 A,2019.10.2 9 Shi-Yan Ren等.Omicron variant （B.1.1.52 9） of SARS- CoV-2: Mutati on, infectivity, trans mission, and vac cine resistance. 《W orld Journal of Cl inical Cases》 .202 2,第10卷(第1期), Long T.Nguyen 等.A thermostable Cas12b from Brevibaci llus levera ges one-pot discrimi nation of SARS- CoV-2 variants of concern. 《eBi oMedicine》 .2022,第77卷 审查员 陈果 (54)发明名称 一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异 性引物组及其应用 (57)摘要 本发明提供了一组针对新冠病毒 omicron株 S基因的特异性引物组及其应用， 所述特异性引 物组包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的 核苷酸序列如SEQ  NO： 1所示， 所述下游引物的核 苷酸序列如SEQ  NO： 2所示， 所述的引物组用于新 冠病毒omicron株S基因的472 ‑474位插入 位点区 RT‑RAA丰度扩增， 建立了与荧光CRISPR切割效应 兼容在一个反应体系中的一步法荧光CRISPR检 测技术， 具有较高的特异性、 灵敏度及稳定性， 并 且操作简便 快捷， 为现场检测、 卫生评价、 临床诊 断等方面 提供了有力的技 术支撑。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114807453 B 2022.09.02 CN 114807453 B 1.一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组， 包括上游引物和下游引物， 其 特征在于， 所述上游引物的核苷 酸序列如SEQ  NO： 1所示， 所述下游引物的核苷 酸序列如SEQ   NO： 2所示， 所述的引物组用于新冠病毒omicron株S基因的472 ‑474位插入位点区RT ‑RAA丰 度扩增。 2.一种一步法荧光CRISPR检测技术的向导crRNA分子， 其特征在于， 其核酸序列如SEQ   NO： 3所示。 3.一种一 步法荧光CRISPR检测技 术的检测试剂盒， 其特 征在于， 包括如下组分： a) RT‑RAA丰度扩增酶， 包括 等温扩增酶和反转录酶； b) SEQ NO： 1所示上游引物， SEQ  NO： 2所示下游引物； c) cas13a酶； d) SEQ NO： 3所示向导crRNA分子； e) 反应缓冲液。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒中， 组分a） 中的等温扩 增酶的工作浓度8～12 µg、 反转录酶的工作浓度为3～7 µg； 组分b） 中所述的引物的工作浓度 为8～12 μM； 组分c） 中Cas13a酶的工作浓度为8～12 µg； 组分d） 中crRNA的工作浓度为10～18 μM。 5.根据权利要求3或4所述的试剂盒， 其特征在于， 组分e)反应缓冲液包括醋酸镁、 RNA 保护剂、 NTP。 6.一种一步法荧光CRISPR检测COVID ‑19 omicron变异株的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 1） 收集含有病毒的样本并提取核酸； 2） 配制反应 体系： 按照权利要求3所述的试剂盒中各个组分配制反应 体系； 3） 上机检测并根据荧 光分析获得检测结果； 所述一步法荧光CRISPR检测COVID ‑19 omicron变异株的方法为非诊断的应用。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 步骤3） 中的上机检测的反应条件为： 1) Reporter选择FAM， Quenc her选择N one， Passive Reference选择N one； 2) 45℃ 4～7 min,收集荧光； 3) 58～62℃ 28～35秒 设置35～45个循环,收集 荧光； 4) 58～62℃ 28～35秒 设置1～3个 循环,收集 荧光； 5)以是否存在扩增曲线或检测值 来判定检测结果。 8.权利要求6或7所述的方法， 其特征在于， 检测的omicron  S蛋白编码基因具有472 ‑ 474位插入位点的突变。 9.权利要求1所述特异性引物组或权利要求2所述的crRNA分子在制备新冠病毒 omicron株S基因472 ‑474位插入位点检测试剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807453 B 2一组针对新冠病毒omicron 株S基因的特异性引物组及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术应用领域， 尤其是一 组针对新冠病毒omicron株S基因的特异 性引物组及其应用。 背景技术 [0002]2021年11月26日， 世界卫生组织将新冠病毒omicron株定义为第五种 “关切变异 株”， 取名希腊字母Omicr on （奥密克戎） 变异株， 随后迅速传播到全球各地， 成为目前全球主 流新冠毒株。 新冠病毒  omicron 株病例相对病毒载量高、 传染性极强、 有的感染者易发展 为重症， 对于新冠病毒的检测， 特别是omicro n变异株的鉴定尤为重要。 [0003]SARS‑CoV‑2是一类呈球形 （有些呈多形） 、 表面有突起、 电镜下观察形似皇冠 的病 毒， 直径在75 ‑160nm。 病毒基因为连续线性单链RNA， 全基因组序列全长约29000  bp， 共包含 14个主要的开放阅读 框 （ORF） ， 能够编码27种蛋白质。 其中S蛋白是病毒表 面的刺突蛋白， 是 病毒进入细胞和介导细胞融合的一个重要的结构 蛋白， 它是感染后中和 抗体的主要目标， 也是治疗和疫苗设计的重点。 新冠病毒omicron株的传染性更强， 源于S蛋白上很多位点的 突变， 其中472 ‑474位插入位点是新冠omicro n株的特征性变异位 点之一。 [0004]目前， 新冠病毒的主要检测方法是实时荧光RT ‑PCR检测技术， 针对的靶点是 ORF1ab和N基因的保守区， 不能鉴定新冠omicron株的关键变异位点。 另外， 目前鉴定 omicron株的方法是实时荧光方法， 并且针对的是变异位点， 不能直接通过扩增曲线来判   读结果， 主 要是依靠 两条扩增曲线的CT值的差值 来判定， 大 大影响了检测的特异性。 [0005]CRISPR检测技术原理是利用RT ‑RPA丰度扩增靶基因片段后， RPA与T7转录相结合， 将扩增后靶基因片段转化为RNA。 然后Cas13a酶在向导crRNA的引导下识别丰度扩增的靶序 列并结合， 激发了它对周围荧光报告RNA的切割， 根据荧光信号判定目的核酸存在。 目前， Cas13a酶主导的CRISPR的检测技术一般分为两步完成， 第一步是RT ‑RPA丰度扩增； 第二步 将扩增产物再用于荧光CRISPR的检测。 现有技术中虽然存在利用CRISPR ‑Cas12n‑NER的方 法检测新冠病毒的方法， 其检测方法和检测灵敏度均有待于进一步提高 （参见参考文献 WANG,X.J.  et al， Rapid  and sensitive  detection  of COVID‑19 using CRISPR/ Cas12a‑based detection  with naked eye readout,  CRISPR/Cas12a ‑NER， Science   Bulletin  65 (2020) 1436–1439） 。 而现有技术中还未有相关的方法利用C as13a酶一步荧 光法针对omicron毒株的检测方法， 也未有针对新冠omicr on株472‑474位插入位点的检测。 本发明即弥补了 现有检测方法中的上述缺陷， 针对新冠omicr on株472‑474位插入位点设计 特异性的引物和crRNA序列， 实现一 步荧光法的灵敏和特异性检测。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供新冠病毒omicron株S基因472 ‑474位插入位点的一步法荧光 CRISPR检测技 术。 主要技术方案为： [0007]我们成功设计和合成了针对新冠病毒omicron株S基因472 ‑474位插入位点区RT ‑说