(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210997320.3 (22)申请日 2022.08.19 (71)申请人 吉林省农业科 学院 地址 130000 吉林省长 春市净月区生态大 街1363号 申请人 东北农业大 学 (72)发明人 郑宇宏　陈庆山　蒋洪蔚　王曙明　 谢建国　李广　 (74)专利代理 机构 沈阳一诺君科知识产权代理 事务所(普通 合伙) 2126 6 专利代理师 刘丽娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) A01H 1/02(2006.01) A01H 1/04(2006.01) G16B 20/20(2019.01) G16B 30/00(2019.01) G16B 40/00(2019.01) G16B 50/30(2019.01) (54)发明名称 一种高亚精 胺含量的大豆 育种方法 (57)摘要 本发明公开了一种高亚精胺含量的大豆育 种方法， 利用现有构建完成的高亚精胺含量种质 ZYD00006和低亚精胺含量种质绥农14染色体片 段代换系群体的重测序结果， 结合2年3点不同环 境条件下亚精胺表型数据， 进行QTL分析获得稳 定表达的大豆亚精胺含量QTL主效位点qSp d19‑ 2， 利用获得稳定表达的大豆亚精胺含量QT L主效 位点qSpd19 ‑2完成qSpd19‑2的精细定位； 结合候 选基因的序列和表达分析图位克隆参与调控大 豆亚精胺含量的相关基因GmqSp d19‑2并研究其 功能， 揭示大豆亚精胺含量分子调控机制， 并进 一步挖掘大豆种质资源中的优异等位变异， 选育 高附加值的富含亚精胺大豆品种提供理论基础 和育种材 料。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 115323071 A 2022.11.11 CN 115323071 A 1.一种高亚精 胺含量的大豆 育种方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 利用现有构建完成的高亚精胺含量种质ZYD00006和低亚精胺含量种质绥农14染色 体片段代换系群体的重测序结果， 结合2 年3点不同环 境条件下亚精胺表型数据， 进 行QTL分 析获得稳定表达的大豆亚精胺含量QTL主效位点qSpd19 ‑2， 筛选带有大豆亚精胺含量QTL主 效位点qSpd19 ‑2且亚精胺含量极端高的大豆个 体； S2、 将筛选 的带有大豆亚精胺含量QTL主效位点qSpd19 ‑2且亚精胺含量极端高的大豆 个体与亲本 绥农14回交， 南繁加代， 获得目标性状次级 F2群体； 筛选亚精胺含量极端个体分 别构建混合池， 采用BSA法进 行QTL分析， 结合F2群体定位结果， 进一步缩短QTL区间； 在此基 础上， 筛选仅目标区间为杂合基因型的个体， 自交创建针对拟窄缩目标区段的次级群体， 构 建目标区域局部 饱和遗传图谱， 完成qSpd19 ‑2的精细定位； S3、 基于qSpd19‑2的精细定位结果， 结合两个亲本及代换系重测序信息， 参照大豆公共 数据库， 将目标区间内标记对应在大豆基因组上， 在亲本基因组中提取目标区间序列信息， 利用生物信息学方法进 行基因预测、 注释及分类， 筛选其中可能与亚精胺合 成、 代谢或调控 相关的基因作为候选基因； 采用qRT ‑PCR鉴定候选基因的表达， 结合亚精胺含量数据， 计算 其表达量与亚精 胺含量的相关性， 最终确定并克隆候选基因G mqSpd19‑2； S4、 利用已经发表的大豆重测序资源， 分析GmqSpd19 ‑2基因的单倍型， 挖掘基因的等位 变异， 并对具有变异的品种进 行亚精胺含量分析， 鉴定亚精胺含量提高的等位变异， 开 发分 子标记， 并将 高亚精胺含量的等位变异 回交导入大豆主栽品种中， 获得高亚精胺含量的大 豆主栽品种。 2.根据权利要求1所述的高亚精胺含量的大豆育种方法， 其特征在于， 所述步骤S2具体 包括： S21、 根据步骤S1的大豆亚精胺含量QTL主效位点qSpd19 ‑2， 筛选携带目标QTL且亚精胺 含量极端高个体材料与亲本绥农14回交， 南繁加代， 获得 目标性状次级F2群体并进行表型 鉴定； 将筛选到的亚精胺含量高、 低 极端个体各30株的DNA等量混合， 构建2个亲本池和2个 极端表型混池； 采用BSA法对亚精胺含量进行QTL分析， 利用IllunimaCasava1.8进行碱基识 别分析， 采用双端150bp测序策略进行基因组测序； 将Wm82.a2.v1作为参考基因组， 使用 GATK软件工具实现SNP的检测， 通过SnpEff软件进行变异注释和预测变异影响； 采用ED和 SNP‑index关联分析法进行关联分析， 集中区域中的SNP标记可作为候选标记进 行后续验证 和精细定位， 对初定位区间进一 步窄缩； S22、 筛选具有窄缩目标片段的杂合个体进行自交， 获得针对窄缩目标片段的次级分离 群体， 在目标区间基因组中利用已有公用引物SSR标记， 同时开发部分SNP和InDel标记， 寻 找并合成尽可能多的双亲差异引物； 利用两个亲本重测序信息在目标区间开 发并合成差异 引物， 对目标区间进行引物扩增， 统计基因型； 应用 3.0软件构建目标区段局部 饱和遗传图谱， 用Kosambi函数将重组率转化成遗传距离cM， 以LOD＝10.0为阈值确定标记 间的顺序， 应用QTLnetwork2.0的NWIM法， 以0.1cM为扫描步长对目标区段进行扫描， 构建目 标区域局部 饱和遗传图谱， 实现qSpd19 ‑2的精细定位。 3.根据权利要求1所述的高亚精胺含量的大豆育种方法， 其特征在于， 所述步骤S3具体 包括： S31、 根据qSpd19 ‑2的精细定位区间内标记在基因组上的对应位置， 在 亲本基因组序列权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115323071 A 2中提取QTL区间对应的序列， 应用基因预测软件进行基因预测， 获得基因序列； 将预测的基 因序列导入InterProScan和UniProt数据库， 滤除假基因， 并在公共数据库中对预测基因进 行BLSAT比对， 对预测基因进行注释及分类， 筛选其中与蛋白质 、 氨基酸形成相关的注释基 因作为候选基因； S32、 根据 大豆基因组信息对定位区间内的候选基因进行功能预测， 获得候选基因在参 考基因组Williams82中的序列， 利用高保真酶扩增亲本中候选基因的全长编码序列并进 行 比较， 预测候选基因编码蛋白的差异； 将栽培大豆绥农14与野生大豆ZYD00006及含有候选 基因的代换系株系种于温室， 按照统一标准， 在R3， R5， R7期对亲本及含有候选基因株系的 籽粒发育时期的胚组织、 花、 荚器官提取总RNA， 并反转录为一链cDNA， 以SOYtubulin为内参 基因， 利用qRT ‑PCR进行表达分析； 通过基因序列分析结合qRT ‑PCR表达分析确定候选基因 GmqSpd19‑2。 4.根据权利要求1所述的高亚精胺含量的大豆育种方法， 其特征在于， 所述步骤S4具体 包括： S41、 利用基因特异引物在已发表的大豆重测序资源中进行PCR扩增并测序， 测序的结 果应用DNAStar软件对序列进行相似性比对分析， 应用DNAsp软件计算单倍型数、 单倍型多 样性、 核苷酸多样性、 平均核苷酸差异数； 利用MEGA软件统计序列的平均碱基组成、 多态位 点数、 简约信息位点数、 总体转换/颠换比率； 分析克隆基因在不同大豆品种中的差异和 变 化规律； S42、 基于所克隆基 因GmqSpd19 ‑2在不同材料间存在的InD el和SNPs位点， 开发InDel标 记或CAPs/dCAPs标记， 通过PCR产物酶切验证的方法快速鉴定大豆种质资源的基因型， 结合 被鉴定资源的表型数据， 阐明功 能标记的选择效率并筛选优异等位变异， 将 高亚精胺含量 的等位变异回交导入大豆主栽品种中， 获得高亚精 胺含量的大豆主栽品种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115323071 A 3