(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211091968.0 (22)申请日 2022.09.07 (71)申请人 辽宁省农业发展服 务中心 地址 110032 辽宁省沈阳市皇姑区辽河街 60号 (72)发明人 杨作丰　周晨阳　魏澍　刘金玲　 佟玉红　董娜　刘俊　李英　 (74)专利代理 机构 安徽善安知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 3420 0 专利代理师 石家惠 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩 增检测系统 (57)摘要 本发明公开了一种非洲猪瘟病毒实时荧光 环介导等 温扩增检测系统， 通过反应体系构建模 块在制得混合反应试剂和DNA聚合酶溶液后， 将 混合反应试剂、 DNA聚合酶和扩增模板加入同一 PCR管中混匀构建出含有多混合物的反应体系， 并分别以阳性对照模板和超纯水为阳性和阴性 对照， 通过荧光值对组织样品的检测结果进行判 定， 并通过所述检测方法验证与分析模块验证该 检测系统对非洲猪瘟病毒检测的特异性和灵敏 度。 本检测系统与常规的PCR检测系统相比较， 其 LAMP引物针对模板的六个区段， 对于非洲猪瘟病 毒检测的特异性更高， 检测结果不易出现假阳 性， 其扩增过程无需变性与退火， 反应时间大大 缩短， 适宜高通量大规模筛查， 且可以减少人工 操作。 权利要求书3页 说明书7页 附图1页 CN 115247220 A 2022.10.28 CN 115247220 A 1.一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 包括LAMP引物的建立与筛选 模块、 组织样品病毒DNA提取模块、 阳性质粒构建模块、 反应体系构建模块和 检测方法验证 与分析模块， 其特 征在于： 所述LAMP引物的建立与筛选模块用于根据非洲 猪瘟病毒B646L基因的保守结构域设计 三对引物， 其中包括一对内引物FIP和BIP、 一对外引物F3与B3和一对环引物LF和LB， 其引物 序列分别为： FIP： 5 ′ ‑TAACGCCACTATGCAGC CCACGGAAGAGCTGA ATCTCTATC CT‑3′； BIP： 5′ ‑CAACATGTGCGA ACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC‑3′； F3： 5′ ‑ATAGGTAATGCGATCG GATACA‑3′； B3： 5′ ‑CCAACAATAACCGCCACGC‑3′； LF： 5′ ‑TCGCCACGCAAAGATAAGC‑3′； LB： 5′ ‑AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT‑3′； 所述组织样品病毒DNA提取模块用于获取LAMP检测所需的扩增模板； 所述阳性质粒构建模块以非洲猪瘟病毒B646L基因为模板， 用特异性引物进行PCR反 应， 将目的片段回收后与pMD18 ‑T载体进行连接， 转化DH ‑5α 感受态细胞后挑菌培养， 然后使 用PCR及LAMP方法验证克隆， 制得 阳性对照模板； 所述反应 体系构建模块用于混合反应试剂和DNA聚合酶的制备； 所述检测方法验证与分析模块用于特异性、 灵敏度的验证评估以及临床样品的检测实 用性评价； 所述反应体系构建模块在制得混合反应试剂和DNA聚合酶溶液后， 将混合反应试剂、 DNA聚合酶和扩增模板加入同一PCR管中混匀构建出含有多混合物的反应体系， 并用D ‑Ⅰ矿 物油缓慢加入PCR管液面， 将反应混合物置于恒温扩增仪的反应槽中， 于65℃恒温反应 12min， 荧光采集周期为20 s， 并分别以阳性对照模板和超 纯水为阳性和阴性对照， 通过荧光 值对组织样品的检测结果进行判定， 若CT值≤40， 则判定组织样品为非洲猪瘟病毒核酸阳 性； 若CT值＞40， 则判定组织样品为 非洲猪瘟病毒核酸阴性， 并通过所述检测方法验证与分 析模块验证该检测系统对非洲猪瘟病毒检测的特异性和灵敏度， 根据出现的S型扩增曲线 的荧光数值对 扩增环境进行优化。 2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 其特 征在于： 所述的扩增模板的获取步骤为： 步骤一： 组织病料的采集与前处 理 具体流程为： 采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、 肝脏、 肾脏、 脾脏等组织样品， 用无 菌的剪刀和镊子剪取待检样品约10g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆 或研磨， 加入0.3 ml～ 0.5ml组织悬液混匀， 60℃， 30min灭活后， 将悬液转入无菌Eppendorf管中， 4℃条件下 5000r/min离心10mi n， 编号备用； 步骤二： 全血及血清样本的采集与前处 理 具体流程为： 使用含有抗凝血剂的无菌管从耳静脉或前腔静脉采集血液3～5ml， 在60 ℃环境下， 经过30min灭活后， 可直接检测； 若检测血清， 可静置全血样本待血清析出后， 直 接吸取至无菌 Eppendorf管中， 在6 0℃环境下， 经 过30min灭活后， 编号备用； 步骤三： 样品DNA的提取 具体流程为： 取10μL前处理过的样本加入无菌1.5ml离心管， 加入10μl样品处理剂， 混权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115247220 A 2匀， 94℃裂解2mi n， 瞬时离心， 取 上清液， 即可获取到所需的扩增模板 。 3.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 其特 征在于： 所述的混合反应试剂的配置方法为： 称取2.4g  Tris， 0.37g氯化钾， 0.12g硫酸镁， 100μL吐温 ‑20， 7.029g甜菜碱， 溶于80mL纯化水， 依次加入终浓度为1.4mmol/L的dNTPs溶 液、 0.2 μmmol/L的外引物溶液、 1.6 μmmol/L的内引物溶液、 0.8 μmmol/L的环引物溶液、 LAMP   TaqMan探针， 加入无菌纯化水定容至100mL， 经过0.22 μm过滤器过滤除菌后， 制得混合反应 试剂。 4.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 其特 征在于： 所述混合反应试剂、 DNA聚合酶、 扩增模板和D ‑Ⅰ矿物油的体积比为2 2:2:1:10 。 5.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 其特 征在于： 所述的特异性评估方法为： 以猪瘟病毒、 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、 猪伪 狂犬病毒、 猪细 小病毒和猪圆环病毒2型五种病原疫苗为特异 性对照， 分别以上述病毒的核 酸为检测模板， 验证该检测方法的特异性。 6.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 其特 征在于： 所述的灵敏度评估方法为： 用超微量分光光度计测定质粒浓度， 将质粒进 行10倍倍 比稀释， 稀释度从10‑1到10‑5， 浓度分别为 1ng/ μL、 100pg/ μL、 10pg/ μL、 1pg/ μL、 100fg/ μL， 每 个稀释度取2 μL作为模板加入到反应体系构建模块中进行恒温扩增， 并绘制S型扩增曲线， 验证该检测方法的敏感性。 7.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 其特 征在于： 所述的临床样品的检测实用性评价方法为： 通过上述检测系统对临床的各种待检 测样品进行检测， 验证该检测方法的临床实用性。 8.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增检测系统， 其特 征在于： 所述特异性引物为F引物和R引物， 其序列号分别为： F： 5 ′ ‑TTAGGTACTGTA ‑ ACGCAGCACAGCT ‑3′和R： 5′ ‑ATGGCATCAGGAG‑GAGCTTTTTG‑3′。 9.根据权利要求1 ‑8任意一项所述的一种非洲猪瘟病 毒实时荧光环介导等温扩增检测 系统， 其特 征在于： 该检测系统的检测步骤如下： 步骤一， 通过所述LAMP引物的建立与筛选模块根据非洲猪瘟病毒B646L基因的保守结 构域设计三对引物， 并将各引物溶解制得引物溶 液； 步骤二， 通过所述组织样品病毒DNA提取模块采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、 肝 脏、 肾脏、 脾脏等组织样品， 裂解离心处 理， 取上清液， 制备 所需的扩增模板； 步骤三， 通过所述阳性质粒构建模块， 以非洲猪瘟病毒B646L基因为模板， 用特异性引 物进行PCR反应， 将目的片段回收后与pMD18 ‑T载体进行连接， 转化DH ‑5α 感受态细胞后挑菌 培养， 然后使用PCR及LAMP方法验证克隆， 制得 阳性对照模板； 步骤四： 通过所述反应体系构建模块制备混合反应试剂和DNA聚合酶溶液， 将混合反应 试剂、 DNA聚合酶和扩增模板加入同一PCR管中混匀构建出含有多混合物的反应体系， 并用 D‑Ⅰ矿物油缓慢加入PCR管液面， 将反应混合物置于恒温扩增 仪的反应槽中， 于65℃恒温反 应12min， 荧光采集周期为20 s， 并分别以阳性对照模板和超 纯水为阳性和阴性对照， 通过荧 光值对组织样品的检测结果进行判定； 步骤五： 通过所述检测方法验证与分析模块分别对非洲猪瘟病 毒检测的特异性和灵敏权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115247220 A 3