(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211083754.9 (22)申请日 2022.09.06 (71)申请人 浙江省淡水 水产研究所 地址 313000 浙江省湖州市吴兴区杭长桥 南路999号 (72)发明人 郭爱环　练青平　盛鹏程　原居林　 罗伟　张爱菊　 (74)专利代理 机构 昆明金科智诚知识产权代理 事务所(普通 合伙) 53216 专利代理师 彭志鼎 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种长春鳊微卫星标记的引物组及其运用 和鉴评方法 (57)摘要 本发明公开了一种长春鳊微卫星标记的引 物组及其运用和鉴评方法， 使用本发 明的微卫星 标记的特异性引物PCR扩增微卫星序列， 取待分 析长春鳊的DNA； 显示引物组的5 ’端标记HEM， 使 用本发明的微卫星标记的引物组进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 将步骤(3)得到的PCR扩增产 物进行毛细管电泳检测， 统计每对 单位点引物扩 增的等位基因数目， 得到统计结果； 记录每对引 物的扩增峰型， 对获得的数据进行分析处理， 评 价长春鳊种质的遗传多样性。 本发 明利用微卫星 建立长春鳊遗传多样性分析技术， 准确度高， 可 以用于长春鳊后期个体识别， 进行增殖放流的效 果评估； 也可进行群体遗传学分析， 对有效防止 其近亲繁殖和种质资源的衰退。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115261489 A 2022.11.01 CN 115261489 A 1.一种长春鳊微卫星标记的引物， 其特征在于， 所述的微卫星标记的特异性引物如下 所示： 微卫星位点N771877特异性引物： F： CGCTGAT TAATCCTCCTCCT， R： AATATTTACCTCGAGCCGCC 微卫星位点N1004204特异性引物： F： GGGCATGAGC CCTCTTAGAT， R： TGTGA ATGTGTCAGTGT TTCAGA 微卫星位点N1229163特异性引物： F： CATGGGGTATGTCCTTGTACCT， R： TTGCGCTACA AAGTGATGCT 微卫星位点N1765979特异性引物： F： CGTGCA AATGTGTTCATGTT， R： ACTTGATTGTGCTTGGCTGG 微卫星位点N2548867特异性引物： F： GACTGTA AACGAAGCTCGGG， R： GCTGCT TCTTCAGTGACGC 微卫星位点N2986794特异性引物： F： CGGAGAAATAGCGCAGACTC， R： CATC CAAGGGCATCGTA AGT 微卫星位点N3407068特异性引物： F： GGCATGAACAGAAACCGAAT， R： AGAGAGCTGCTGT TTGCTGC 微卫星位点N5571249特异性引物： F： TATTTCAGGAAGCACGGAGG， R： GGGCTGTGCAT TTAAAGGTG 微卫星位点N5671554特异性引物： F： TGCTGTATA AGTGCAGT TCATCATT， R： CCATGATGGTTAATCGCTACA A 微卫星位点N5986326特异性引物： F： GCATTATTTAACGTGCAGC C， R： CTCAG GCTTAGGTGAGGGTG。 2.一种权利要求1所述的引物组合物在鉴评 长春鳊遗传多样性中的应用。 3.一种鉴评 长春鳊遗传多样性的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)取待分析长 春鳊的DNA； (2)显示引物组的5 ’端标记HEM； (3)引物组进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物； (4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测， 统计每对单位点引物扩增的 等位基因数目， 得到统计结果； (5)记录每对引物的扩增峰型， 对获得的数据进行分析处理， 评价长春鳊种质的遗传多 样性。 4.根据权利要求3所述的一种鉴评长春鳊遗传多样性的方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 提取分析长 春鳊的DNA时， 以长 春鳊的腹部 肌肉组织作为 提取样本 。 5.根据权利要求3所述的一种鉴评长春鳊遗传多样性的方法， 其特征在于： 所述PCR的 扩增体系(2 5 μL)包含为2 ×Taq PCR Mix 12.5 μL,双蒸水6.5 μL,上游和下游引物各 1 μL(5'‑ FAM or 5'‑HEX)和DNA模板(10 0ng/ul)4 μL。 6.根据权利要求3所述的一种鉴评长春鳊遗传多样性的方法， 其特征在于： 所述PCR的 扩增程序为95℃5min， 95℃30s、 45 ‑60℃30s、 72℃30s共30个循环， 95℃30s、 53℃30s、 72℃ 30s共10个 循环， 60℃30min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261489 A 2一种长春鳊微卫星标记的引物组及其运用和鉴评方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学DNA标记技术领域， 特别涉及一种长春鳊微卫星标记的引 物组及其 运用和鉴评方法。 背景技术 [0002]长春鳊(Parabramis  pekinensis)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、 鲤科 (Cyprinidae)、 鲌亚科(Cultrinae)、 鳊属(Parabrami s)， 俗名鳊花， 生长较快， 其肉质嫩滑， 味道鲜美， 营养价值高， 深受消费者的青睐， 是淡水鱼中的佳品。 在我国长春鳊的分布较为 广泛， 喜生长于江河、 湖泊、 水库的水体中上层， 喜躲在水生植物 丛中， 幼鱼大多生存在水深 较浅或水流较为缓慢的水域中。 [0003]微卫星DNA又称为简单序列重复(Simple  Sequence  Repeats， SSR)或短串联重复 序列(Short  Tandem Repeats， STR)， 一般由1～6bp的核心重复单位和重复区域两端的保守 序列两部分组成， 不同的重复数目和重复位置是形成微卫星位点多态性的基础， 微卫星分 子标记其诸多优点和巨大 的应用前景， 被广泛应用于各种生物学研究中， 在水产动物中主 要应用群体遗传学、 亲缘关系鉴定与个体识别、 遗传图谱的构建和分子标记辅助育种等方 面。 [0004]本研究利用高通量随机测序的方法对长春鳊进行了微卫星标记挖掘， 并利用多态 微卫星标记对一个长春鳊亲鱼群体进 行种群遗传学特征评价， 以期为长春鳊的分子辅助育 种提供帮助， 为培 育优质、 高产、 抗逆、 抗病的长 春鳊优良品种奠定基础。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种长春鳊微卫星标记的引物及其运用和鉴评方法， 利用微 卫星建立长春鳊遗传多样性分析技术， 准确度高， 可以用于长春鳊后期的增殖放流效果评 估， 也可有效防止 近亲繁殖和种质资源的衰退。 [0006]本发明的上述 技术目的是通过以下技 术方案得以实现的： [0007]1、 高通量测序 [0008]长春鳊个体DNA提取： 随机选择的长春鳊个体的鳍条组织并无水酒精 保存， 对基因 组DNA进行， 1％的琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测后， 置 于‑20℃保存。 [0009]长春鳊高通量测序与微卫星位点的挖掘： 使用HiSeq2500高通量测序仪 (Illumina， USA)对长春鳊的基因组DNA进行全基因组随机测序(测序服务由阅微基因有限 公司提供)， 得到二代测序数据， 过 滤掉接头、 低质量序列后使用MISA软件搜索微 卫星位点。 [0010]2、 SSR序列的筛 选 [0011]筛选标准包括以双核苷酸为重复单位时， 其重复数大于或等于6次； 以三核苷酸为 重复单位时， 其重复数大于或等于5次； 以四核苷酸为重复单位时， 其重复数大于或等于5 次； 以五核苷酸为重复单位时， 其重复数至少为4； 以六核苷酸为重复单位时， 其重复数大于 或等于4次。说　明　书 1/5 页 3 CN 115261489 A 3