(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210853070.6 (22)申请日 2022.07.20 (71)申请人 成都海关技 术中心 地址 610000 四川省成 都市武侯区一环路 南四段28号 (72)发明人 邵宝林　刘露希　杨益芬　陈华保　 付志玺　鲁昕　宿白玉　陆丽华　 徐艳　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 李小伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G01N 21/84(2006.01) G01N 27/447(2006.01) G01N 33/00(2006.01) (54)发明名称 一种银胶菊 检疫鉴定方法 (57)摘要 本发明涉及外来入侵杂草鉴定技术领域， 具 体为一种银胶菊检疫鉴定方法， 适用于外来入侵 杂草监测 中银胶菊的检疫鉴定及进境粮食携带 银胶菊总苞或瘦果的检疫鉴定。 了解银胶菊基本 信息， 根据本文件描述的形态鉴定特征等信息， 在外来入侵生物普查监测到菊科杂草植株或在 进境粮食筛下物中发现菊科杂草籽实， 将疑似 银 胶菊样品带回实验室检测鉴定。 样品在形态特征 完好的情况下， 可按系统分类学方法进行鉴定； 在鉴定特征缺失或不完整等不适宜外观形态鉴 定情况下， 采用特异PCR检测及基因测序鉴定的 方式， 实现银胶菊的精准 鉴定。 权利要求书3页 说明书7页 附图3页 CN 115161410 A 2022.10.11 CN 115161410 A 1.一种银胶菊检疫鉴定方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： S1： 鉴定仪器、 用具以及试剂准备的准备， 了解银胶菊基本信息； S2： 样品采集： S2.1： 杂草监测样品， 在外来入侵生物普查或海关监管场所及其周边监测菊科杂草植 株， 记录地理坐标等样品来源信息， 将疑似植株带回实验室检测鉴定； S2.2： 进境植物产品， 以进境粮食为例， 将现场检疫抽取的复合样品充分混匀， 制成平 均样品， 采用四分法， 取平均样品的二分之一至四分之三(较少样品时)作为试验样品， 称取 其重量并记录： 其余的作为保留样品， 称 重并记录， 加贴标签保存， 送检样品不足1.0kg的全 部检测， 根据样品个体的直径确定套筛的规格， 从大到小依 次套上不同孔径的规格筛并加 上底筛， 将适量样品倒入规格筛的上层内， 盖上筛盖， 用回旋法过筛(或用电动筛振荡)， 使 样品充分分离， 把过筛的筛上物和筛下物分别倒入白瓷盘内， 用镊子挑取杂草籽实， 放于培 养皿内， 混杂于植物原粮和种子中的银胶菊总苞或瘦果， 一般在孔径为5mm筛下物中获得， 当样品量少时， 也可将全部样品放入白瓷盘中进行人工挑检， 在体视显微镜或放大镜下镜 检， 进行植株花部特 征和瘦果内部特 征观察时， 辅以解剖刀、 解剖针等工具； S3： 样品鉴定： S3.1： 形态学鉴定： 首先判断样品是否为菊科， 菊科特征， 草本、 亚灌木或灌木， 稀为乔木， 有时有乳汁管或 树脂道， 叶通常互生， 稀对生 或轮生， 全缘或具齿或分裂， 无托叶， 或有时叶柄基部扩大成托 叶状， 花两性或单性， 极少有 单性异株， 整齐或左右对称， 五基数， 少数或多 数密集成头状花 序或为短穗状花序， 为 1层或多层总苞片组成的总苞所围绕， 头状花序单生 或数个至多数排 列成总状、 聚伞状、 伞房状或圆锥状： 花序托平或凸起， 具窝孔或无窝孔， 无毛或有毛， 具托 片或无托片， 萼片不发育， 通常形成鳞片状、 刚毛状或毛状的冠毛， 花冠常辐射对称， 管状， 或左右对称， 两唇形， 或舌状， 头状花序盘状或辐射状， 有同形的小花， 全部为管状花 或舌状 花， 或有异形小花， 即外围为雌花， 舌状， 中央为两性的管状花， 雄蕊4～5个， 着生于花冠管 上， 花药内 向， 合生成筒状， 基部钝， 锐尖， 戟形或具尾； 花柱上端两裂， 花柱分枝 上端有附器 或无附器； 子房下位， 合生心皮2枚， 1室， 具1个直立的胚珠， 果为不开裂的瘦果： 种子无胚 乳， 具2个， 稀1个子叶； 样品为菊科， 鉴定样品是否具有银胶菊属特征， 银胶菊属特征： 一年生或多年生草本、 亚灌木或直立灌木， 被绒毛、 绵状绒毛或无毛， 叶互生， 全缘具齿或羽裂， 头状花序小， 有异 型小花， 放射状， 多数排列成稠密或疏松的圆锥花序或伞房花序， 外围雌花1层， 结实， 中央 两性花多 数， 不结实， 全部花冠白色或浅黄 色， 总苞钟状或半球形： 总苞片2层， 覆瓦状排列， 外层宽， 与内层等长或略短， 花托小， 凸起或圆锥状， 有膜质楔形的托片， 雌花花冠舌状， 舌 片短宽， 顶端凹入， 2或3齿裂： 两性花花冠管状， 向上逐渐扩 大， 顶端4～5裂， 雄蕊4～5个， 花 药顶端卵状渐尖或锥尖， 基部无尾， 雌花花柱分枝2： 两性花花柱不分枝， 顶端头状或圆球 状， 雌花瘦果背面扁平， 腹面龙骨状， 无毛或被短柔毛， 其与内向左右侧2朵被鳞片包裹着的 两性花一同着生在总苞片的基部， 冠毛2 ～3， 刺芒状或鳞片状； 银胶菊鉴别特征： 银胶菊是一年生草本植物， 具主根， 茎直立， 高0.6m～1.8 m， 基部径约 5mm， 中上部多分枝， 具条 纹， 被短柔毛， 节间长2.5cm～5.0cm， 叶的形态及大小变化多样， 下 部和中部叶二回羽状深裂， 全形卵 形或椭圆形， 连叶柄长10cm～19cm， 宽6cm～11cm， 羽片3权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115161410 A 2～4对， 卵形， 长3.5cm～7cm， 小羽片卵状或长圆状， 常具齿， 顶端略钝， 上面被基部为疣状的 疏糙毛， 下面的毛较密而柔软： 上部叶无柄， 羽裂， 裂片线状长圆形， 全缘或具齿， 或有时指 状3裂， 中裂片较大， 通常长于侧裂片的3倍， 花期4～11月， 头状花序多数， 径3mm～4mm， 在茎 枝顶端排成开展的伞房花序， 花序柄长3mm～8mm， 被粗毛： 总苞宽钟形或近半球形， 径约 5mm， 长约3mm： 总苞片2层， 各5个， 外层较硬， 卵形， 长2.2mm， 顶端叶质， 钝， 背面被短柔毛， 内 层较薄， 几近圆形， 长宽近相等， 顶端钝， 下凹， 边缘近膜质， 透明， 上部被短柔毛， 舌状花1 层， 5个， 白色， 长约1.3mm米， 舌片卵形或卵 圆形， 顶端2裂， 管状花多数， 长约2mm， 檐部4浅 裂， 裂片短尖或短渐尖， 具乳头状突起： 雄蕊4个， 雌花瘦果倒卵形， 基部渐尖， 干时黑色、 长 约2.5mm， 被疏腺点， 冠毛2， 鳞片状， 长圆形， 长约0.5m m， 顶端截平或有时具细齿； S3.2： 分子生物学鉴定： DNA提取及浓度测定， 使用常见商品化试剂盒提取基因组DNA， 用以提取核酸的植物组 织用量参照所采用商品化试剂盒使用说明， 用紫外 分光光度计或核酸浓度测定仪检测所提 取核酸浓度， 浓度以达 到商品化PCR试剂盒中要求的DNA模板用量 为准； 特异PCR检测， 防污染措施应符合GB/T19495.2中7.4的规定， 引物序列： Ph ‑F： 5’ ‑ CGTTATGTTTCGGTCCTTGC ‑3’， Ph‑R： 5’ ‑ACTAGCCATGCCTCCCTTC ‑3’， 该引物为特异引物， 每次 做PCR需要做空白对照， 以确认是否 污染， PCR反应体系： 采用商品化的PCR试剂盒进行PCR扩增， 推荐用25 μLPCR反应体系， 反应体 系中引物10 μmo l/L各1.0 μL： 模板DNA含量约20ng或以所采用的商品化试剂盒说明书为 准； PCR扩增程序： 94℃， 4min； 94℃， 1min、 57℃， 30s、 72℃， 45s， 35个循环； 72℃， 5min； 4℃ 保存， PCR扩增程序可根据商品化试剂盒说明做适当调整， 退火温度推荐为57℃， 电泳检测： 扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳， 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外 透射光下观察是否仅扩增出一条486bp左右的DNA条 带， 并拍摄记录， 测序鉴定： 当电泳检测仅扩增出一条486bp的DNA条带， 将PCR产物送有资质的生物技术 公司进行双向测序， 结果经 软件拼接和人工校对后,与参 考序列进行比对； 参考序列： GATGCCTTGTCAGCTTGTGTGTATGTTGCCCCGTACATACTGGGCTTCATGGATATCATGCTG ACATAATAACAAACCCCCGGCACGGGACGTGCCAA GGATAAATAAACTTAAAA GGGCTTGTGCCATTGCGCCCCGT TTGCGGTGTGCGCATTGTACTGGTGCCTTTGTAAACTTAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCAT CGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCA GAATCCCGTGAACCATCGA GTTTTTGAACGCAA GTTGCGCCCGAA GCCATCCGGTTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCATGTTGCCCCAACCAA GCATCCC TTTTTAGGGACGTCCTTGGTTGGGGCGGA GATTGGTCTCCCGTGCCCAA GGCGTGGTTGGCCTAAATA GT