(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210612127.3 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 中国长江三峡集团有限公司中华鲟 研究所 地址 443100 湖北省宜昌市 夷陵区集锦路2 号 (72)发明人 肖衎　杜合军　杨菁　曲焕韬　 黄红涛　舒婷婷　 (74)专利代理 机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 专利代理师 王玉芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对， 试 剂盒及鉴定方法 (57)摘要 本发明提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的 COI引物对， 试剂盒及鉴定方法， 属于动物分子遗 传学领域。 试剂盒利用1对线粒体COI序列特异性 引物对鱼类样本进行PCR扩增反应， 反应后发现 PCR扩增条带在圆口铜鱼和铜鱼之间存在具有较 大差异， 通过凝胶电泳显示可以直接鉴定出圆口 铜鱼和铜鱼。 本发明在鲤科铜鱼属的两种鱼类中 设计1对引物进行PCR扩增、 凝胶电泳显示直接进 行分析鉴定， 具有实验准确， 鉴定可靠快捷， 操作 简便等优点。 利用本方法可以快速鉴别圆口铜鱼 和铜鱼两个物种， 对圆口铜鱼规模化放流的种质 鉴定提供了技 术支撑。 权利要求书1页 说明书11页 序列表4页 附图2页 CN 114941034 A 2022.08.26 CN 114941034 A 1.一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对， 其特征在于： 所述COI引物对由SEQ ID NO:1 所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成。 2.根据权利要求1所述的COI引物对在制备鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒中的应用。 3.一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒， 其特征在于： 包括权利要求1所述的COI引物对， Taq DNA聚合酶， 10 ×PCR Buffer， dNTP， MgCl2， d dH2O。 4.一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： （1） 提取样品的基因 组DNA； （2） 以步骤 （1） 提取的基因组DNA为模板， 采用权利要求3所述的试剂盒对DNA模板进行 扩增； （3） 根据步骤 （2） 中的扩增结果进行判定： 若扩增出两个条带， 则DNA模板来源于圆口铜 鱼； 若扩增出一个明亮条 带， 则DNA模板来源于铜鱼。 5.根据权利要求4所述的一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法， 其特征在于： 所述扩增体系 如下： 10×PCR Buffer 2.5 μL dNTP （2.5m mol/L） 0.5 μL MgCl2 1.5 μL Taq DNA聚合酶 0.5 μL 前引物 0.1 ‑1.0 μL 后引物 0.1 ‑1.0 μL DNA模板 0.5 ‑2.0 μL ddH2O 补足至20 μL。 6.根据权利要求4， 5任一项所述的一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法， 其特征在于， 所述 DNA模板的浓度为10 0‑500ng/ μL。 7.根据权利要求4， 5任一项所述的一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法， 其特征在于， 所述 前引物或所述后引物在扩增体系中的浓度为10 0‑1000 pmol/ μL。 8.根据权利要求4所述的一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法， 其特征在于， 所述扩增程序 为： 93‑95℃预变性3 ‑5min； 93‑95℃变性2 5‑35s， 55‑60℃退火30 ‑50s， 72℃延伸30 ‑60s， 30‑ 40个循环； 72℃延伸5 ‑10min； 4℃保存。 9.根据权利要求4或8所述的一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法， 其特征在于， 所述扩增 程序为： 94℃预变性3min； 94℃变性30s， 退火温度58℃复性30s， 72℃延伸30s， 35个循环； 72 ℃延伸10mi n； 4℃保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114941034 A 2一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对， 试剂盒及鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对， 试剂盒及鉴定方法， 属于动 物 分子遗传学领域。 背景技术 [0002]圆口铜鱼(Coreiμs  guichenoti)隶属鲤形目(Cypriniformes)、 鮈亚科 (Gobioninae)、 铜鱼属(Coreius)， 主要分布在长江上游水域， 是当地重要的经济鱼类和主 要捕捞对象， 也是长江上游珍稀 特有鱼类保护区的指标性物种。 近年来， 随着长江上游水电 站的大力开 发和过度捕捞对生态环境的影响， 圆口铜鱼产卵场遭到破坏、 洄游 通道被阻断， 其种群资源量急剧下降， 物种 生存面临巨大威胁， 2016年被列入极危(CR)等级。 因此， 加强 圆口铜鱼种群资源保护和恢复工作已极为迫切。 目前， 增殖放流被认为是圆口铜 鱼资源保 护和生态修复的主 要途径之一。 [0003]为了保证放流的生态安全性， 必须严格控制放流种类和来源。 放流苗种原则上要 以本地原种和子一代苗种为主， 不得向天然水域中投放杂交种、 转基因种及种质不纯等不 符合生态安全要求的物种。 为保证放流圆口铜 鱼的种质纯正性和遗传质量， 有必要对放流 苗种进行鉴定。 鲤科铜鱼属共三种鱼类， 分别为圆口铜鱼(Coreius  guichenoti)、 铜鱼 (Coreius heterodon)和北方铜鱼(Coreius  septentrionali s),其中北方铜鱼为黄河流域 特有鱼类， 仅分布于黄河水系， 故长江流域圆口铜鱼放流主要干扰种类为铜鱼， 圆口铜鱼和 铜鱼在早期发育阶段形态特征相似， 仅从形态上难以进行鉴别， 因此需要一种从基因组的 特异性出发的快速鉴定方法。 [0004]细胞色素C氧化酶亚基I(COI)位于线粒体基因组上， 是线粒体基因组的13个编码 蛋白质的基因中分子量最大， 功能结构域最为保守的基因。 同时C OI基因由于其氨基酸的演 化速率较慢可以区分分异时间较远的种类， 同属物种的C OI基因序列又存在有足够的变异， 能够区分亲缘关系很近的种类， 所以COI基因被广泛用于不同分类阶元层次上的分子系统 学研究。 不仅如此， COI基因在保证足够变异的同时很容易被通用引物扩增， 能够获得绝大 多数动物的5 ’端序列， 其序列又很少有插入或缺失发生， 因而COI基因被选为DNA分类的标 记基因； 同时在利用PCR技术进行物种鉴定中应用前景十分广阔。 因此COI基因可以用来鉴 定圆口铜鱼和铜鱼。 发明内容 [0005]鉴于上述问题， 本发明提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对， 试剂盒及鉴 定方法， 该引物对、 试剂盒及鉴定方法可以快速从分子层面鉴定圆口铜鱼和铜鱼， 且方法简 单易操作， 准确度高。 [0006]本发明解决上述 技术问题的技 术方案如下： [0007]本发明提供了一种鉴定圆 口铜鱼和铜鱼的COI引物对， 该COI引物对由SEQ  ID NO: 1所示的上游引物和SEQ  ID NO:2所示的下游引物组成。说　明　书 1/11 页 3 CN 114941034 A 3