(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210692896.9 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 中国科学院南海 海洋研究所 地址 511458 广东省广州市南沙区海 滨路 1119号 申请人 南方海洋科学与工程广东省实验室 （广州） (72)发明人 何毛贤　姚高友　张华　 (74)专利代理 机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 专利代理师 朱聪聪　刘明星 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01) G16B 20/00(2019.01) G16B 50/00(2019.01) G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 一种通过快速检测底栖生物组成初步探测 深海活动冷泉的方法 (57)摘要 本发明公开了一种通过快速检测底栖生物 组成初步探测深海活动冷泉的方法， 属于海洋技 术领域。 本发明方法包含如下步骤： S1： 采集待测 环境样本； S2： 环境样本过滤与eDNA提取； S3： 对 eDNA进行PCR扩增与高通量测序； S4： 根据测定序 列进行OTU聚类； S5： 对比NCBInt数据库， 对OTU序 列进行物种注释； S6： 依据所统计的底栖生物物 种信息， 初步评估待测位点是否为活动冷泉， 活 动冷泉评估的标准为： 注释信息中存在深海贻贝 的注释序列， 且该序列的read数量占所测样本总 reads数的4％以上。 与其他现有方法相比， 本发 明方法检测经济、 简单， 无需频繁使用ROV或MOV 进行深海原位观测就能够对目标区域进行高通 量、 一次性检测鉴定大量的深海底栖生物物种， 并根据物种组成信息， 初步判定目标区域是否为 活动冷泉 。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115161404 A 2022.10.11 CN 115161404 A 1.一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的方法， 其特征在于， 包括 如下步骤： S1： 采集待测环境样本； S2： 环境样本过 滤与eDNA提取； S3： 对eDNA进行PCR扩增与高通 量测序； S4： 根据测定序列进行OT U聚类； S5： 对比NCBI  nt数据库， 对OT U序列进行物种注释； S6： 依据所统计的底栖生物物种信息， 初步评估待测位点是否为活动冷泉， 活动冷泉的 评估的标准为： 样本中存在深海贻贝物种的注释序列， 且该序列的read数量占所测样本总 read数量的4％以上。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S1所述的环境样本为海底原位水环境 样本。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S2所述的环境样本过滤， 是将处理水 样采用无菌的孔径为0.45 μm的水合纤维素 滤膜过滤， 并于液氮中保存。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 步骤S3所述的PCR扩增， 其引物为： MlCOIintF： 5’ ‑GGWACWGGWTGAACWGTWTAY CCYCC‑3’； JghHCO2198： 5 ’ ‑TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA‑3’。 5.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR扩增的条件为： 95℃预变性 5min； 95℃变性3 0s， 55℃退火3 0s， 72℃延伸45s， 3 5个循环； 72℃延伸10mi n。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR扩增的体系为： 5 ×FastPfu  Buffer 4μl， 2.5mM  dNTPs 2μl， 正反向引物各0.8μl， FastPfu  Polymerase  0.4μl， Template DNA 10ng， ddH2O补齐至20 μl。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S3所述高通量测序， 其原始数据优化 的去杂方法和参数为： (1)过滤read尾部质量值20以下的碱基， 设置50bp的窗口， 如果窗口内的平均质量值低 于20， 从窗口开始截去后端碱基， 过 滤质控后5 0bp以下的read； (2)根据PE  reads之间的overlap关系， 将成对reads拼接(merge)成一条序列， 最小 overlap长度为10bp； (3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率 为0.2， 筛除不符合的序列； (4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品， 并调整序列方向， barcode允许的错 配数为0， 最大引物错配数为2； (5)用Usearc h软件和go ld数据库， 采用de  novo和reference 结合的方式去除嵌合体。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S4所述的根据测定序列进行OTU聚类 是利用软件Vsearch  2.3.4对高质量序列在97％的相似性水平上进行聚类， 产生可操作性 分类单元(operati onal taxonomic units， OTUs)。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S5所述对OTU序列进行物种注释的标 准为： Identity>97％， E值<10‑100。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115161404 A 2一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的 方法 技术领域： [0001]本发明属于海洋技术领域， 具体涉及一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深 海活动冷泉的方法。 背景技术： [0002]冷泉分布于海底1000m及以下活动和被动的大陆边缘斜坡， 主要包含水、 甲烷为主 的碳氢化合物、 硫化氢等物质。 在特定的温度和压力下， 海底储存的天然气水合物和天然气 会达到一种平衡状态， 使得天然气从海底深处沿着一定的通道向海底表面扩散， 并向上溢 出从而形成活动冷泉。 因此， 活动冷泉常伴随着储量丰富的 “可燃冰”(天然水合物)。 “可燃 冰”被认为是未来能够替代石油等传统化石燃料 的新兴能源， 具有重要的战略价值。 同时， 在活动冷泉区还常发现伴存在大量冷泉底栖生物， 深海冷泉底栖生物中蕴藏着极其丰富的 基因资源， 对耐低 温及重金属解毒等相关功能基因的挖掘与利用， 能为生物医学、 工业、 环 境、 能源等领域产生重要的影响。 [0003]当前对活动冷泉探测的主要方法是首先基于地质、 地球物理调查等前期研究工 作， 圈定潜在海底 “冷泉”区， 然后利用无人深潜器(ROV)或有人深潜器(MOV)对潜在目标海 区进行逐一排查， 这种方法要需利用ROV或M OV频繁下潜 到海底进 行现场的观测来确定是否 为活动冷泉， 存在耗时耗力且费用高等诸多不便。 此外， 活动冷泉底栖生物多样性的调查主 要通过海底原位拍摄、 肉 眼辨识， 室内逐个分析鉴定等技术手段， 这些手段会遗漏一些不易 被发现的物种； 由于水深 较深(通常超 过1000m)， 生物个体也较难获取、 生物 量难统计， 耗时 且效率低。 基于以上活动冷泉探测及冷泉底栖生物多样性调查耗时、 成本高且效率低的背 景。 发明内容： [0004]为了克服上述问题， 本发明通过采集深海冷泉区原位底层水样， 并对水样中的遗 传物质进行高通量DNA测序并鉴定冷泉底栖物种组成， 根据水环境样本中的物种组成初步 探测目标区域是否为活动冷泉， 本发明方法具有通 量高、 易于检测极大减少工作量的特点。 [0005]本发明的目的是提供一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的 方法， 包括如下步骤： [0006]S1： 采集待测环境样本； [0007]S2： 环境样本过 滤与eDNA提取； [0008]S3： 对eDNA进行PCR扩增与高通 量测序； [0009]S4： 根据测定序列进行OT U聚类； [0010]S5： 对比NCBI  nt数据库， 对OT U序列进行物种注释； [0011]S6： 依据所统计的底栖生物物种信息， 初步评估待测位点是否为活动冷泉， 活动冷 泉评估的标准为： 样本中存在深海贻贝物种的注释序列， 且该序列的read数量占所测样本说　明　书 1/4 页 3 CN 115161404 A 3