(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210755672.8 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 南开大学 地址 300457 天津市滨 海新区宏达街23号1 区 (72)发明人 郭玺　刘斌　武潘　王婧　 (74)专利代理 机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 专利代理师 朱红星 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测方法及 应用 (57)摘要 本发明涉及基于MGB探针的实时荧光PCR反 应快速检测体系对4种迟缓爱德华菌血清型菌株 进行检测。 本发明以4种血清型迟缓爱德华菌的 wzx基因为靶基因， 设计和筛选了针对每一个血 清型的Taqman特异性引物及MGB探针， 并建立了 实时荧光PCR检测方法。 利用本发明提供的方法 可以准确、 快速、 灵敏地对4种迟缓爱德华菌 血清 型菌株进行分子生物学检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 114854886 A 2022.08.05 CN 114854886 A 1.一种对不同迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物， 其特征是在4种血清型的迟缓爱 德华菌G6053、 G6057、 G6058、 G6059的 wzx基因中分别选取的2 个DNA片段， 其引物序列依次如 SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:8所示。 2.一种对4种血清型的迟缓爱德华菌分别特异的MGB探针， 其特征是位于权利要求1中2 个Taqman引物的内部， 且含有5'报告染料FAM和3'非荧光猝灭剂NFQ， 在3'末端与小沟结合 物MGB缀合， 其探针序列依次如SEQ  ID NO:9‑SEQ ID NO:12所示。 3.权利要求1所述的对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物在用于检测迟 缓爱德华菌方面的应用。 4.权利要求2所述的MGB探针在用于检测迟缓爱德华菌方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854886 A 2一种迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于细菌检测方法技术领域， 涉及用于迟缓爱德华菌4种血清型的实时荧 光PCR检测方法及应用。 背景技术 [0002]迟缓爱德华菌可在大多数水环境中生存， 是一种人畜共患病菌， 可对多种经济型 鱼类造成感染， 造成严重的经济损失。 同时， 该菌也可以感染哺乳动物及人类， 其中最常见 的感染疾病是胃肠炎， 若不慎引发肠外或全身感染， 还可导 致较高的死 亡率。 [0003]细菌的血清型与致病性密切相关， 同一种内不同血清型细菌的致病性往往存在着 很大差异。 血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用， 至今已有超过80年的历史， 可在 种/属内将细菌进一步分类， 是一种重要的细菌鉴定方法， 目前， 血清学鉴定方法是应用最 为普遍的致病菌鉴定和 溯源方法。 传统血清学鉴定方法虽被广泛使用， 但仍存在 诸多缺陷。 主要包括： 建立血清学分型系统的工作繁琐、 周期长； 血清的生产和质控较为困难； 同一血 清型菌株与不同抗血清容 易发生交叉反应等。 [0004]细菌表面多糖抗原主要包括O多糖 （O抗原） 、 普通抗原 （CA） 、 胞外多糖抗原、 芽孢、 以及荚膜多糖 （K抗原） 等。 基于上述表面多糖抗原的多样性， 细菌可被分为不同的血清型。 同一细菌不同血清型的O抗原多样性， 是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传 多样性 决定的， 这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点， 被称作O抗原基因簇。 其中， 编码O 抗原翻转酶的 wzx基因和聚合酶的 wzy基因， 通常具备血清型特异性， 被用作利用分子生物 学手段开发致病菌血清型鉴定技 术的检测靶标。 [0005]TaqMan实时荧光PCR （Real ‑time fluorescence  PCR） 技术原理是， 将标记有荧光 素的TaqMan探针与模板DNA混合后， 完成高温变性， 低温复性， 适 温延伸的热循环， 并遵守聚 合酶链反应规律， 与模板DNA互补配对的TaqMan探针被切断， 荧光素游离于反应体系中， 在 特定光激发下发出荧光。 随着 循环次数的增加， 被扩增的目的基因片段呈指数规律增长， 通 过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度， 求得循环阈值 （Ct值） ， 即可表征检测 样品的类型和含量。 [0006]TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针， 其  5' 末端携带荧光基团， 如FAM、 TET、 VIC、 HEX等，  3' 端携带淬灭基团， 如TAMRA、 BHQ等。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针， 探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增 时， Taq 酶的5'‑3'外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从 而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条DNA链， 就有一个荧光分子形成， 实现了 荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 [0007]TaqMan‑MGB 探针是近年来在  TaqMan探针的基础上改进的一种新技术， 它在探针   3′  端增加了MGB分子， 这种物质能够提高探针的退火温度(  Tm值) ， 从而使它能够分辨  1 个碱基的差别， 完全配对， 有荧光信号； 只要有一个碱基不匹配， 就没有信号。 探针的设计首 先为15‑30 nt长度， Tm为68 ‑70 ℃。 探针由AuGCT  Biotechnology  Corporation （中国北说　明　书 1/7 页 3 CN 114854886 A 3