(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210648293.9 (22)申请日 2022.06.10 (71)申请人 盐城师范学院 地址 224002 江苏省盐城市亭湖区希望大 道南路2号 申请人 南京农业大 学 (72)发明人 孙淼　熊爱生　尹莲　朱志鹏　 王博文　刘方方　杨菊　 (74)专利代理 机构 宁波海曙甬睿专利代理事务 所(普通合伙) 33330 专利代理师 肖婧 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G16B 25/20(2019.01) (54)发明名称 一种芹菜番茄红素ε-环 化酶基因克隆及功 能鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶 基因克隆及功能鉴定方法， 包括以下步骤： 步骤 一： 选取三种伞形科蔬菜： 芹菜、 香菜和胡萝卜以 及拟南芥的基因组数据进行LCY基因家族鉴定和 分析， 步骤二： 分析LCY基因家族的染色体定位、 共线性关系、 保守基序和启动子区的顺势作用元 件， 使用MCScanX软件对三个伞形科基因组进行 共线性分析， 提取含有LCY基因的同源基因对， 本 发明通过将芹菜中番茄红素环化酶基因家族 (LCY基因家族)进行鉴定， 从分子层面为探究芹 菜中叶黄素芹菜番茄红素环化酶基因家族鉴定 及番茄红素ε ‑环化酶基因功能分析和β ‑胡萝 卜素提供参考， 为进一步研究LCY基因在芹菜非 生物胁迫下的作用奠定基础， 为后续抗逆优质芹 菜育种提供了帮助。 权利要求书2页 说明书5页 CN 115011722 A 2022.09.06 CN 115011722 A 1.一种芹菜番 茄红素 ε‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 步骤一： 选取三种伞形科蔬菜： 芹菜、 香菜和胡萝卜以及拟南芥的基因组数据进行LCY 基因家族鉴定和分析； 步骤二： 分析LCY基因家族的染色体定位、 共线性关系、 保守基序和启动子区的顺势作 用元件， 使用MCScanX软件对三个伞形科基因组进行共线性分析， 提取含有LCY基因的同源 基因对， 使用TBtools软件进行可视化展示， 并对LCY基因家族进行内含子、 外显子结构分 析， 使用MEME网站对LCY基因家族进行保守基序的鉴定， 将基序最大搜寻数量设置为20， 其 他的参数默认， 使用TBtools提取LCY基因上游1500bp区域， 利用PlantCARE软件鉴定LCY基 因启动子区域 顺式作用原件； 步骤三： 对芹菜、 香菜、 胡萝下和 拟南芥的LCY基因进行了多序列比对和系统发育分析， 首先， 利用ClustalW2进行多序列比对， 然后使用IQTREE软件的模型搜索功能确定最佳模 型， 利用Evo lview网站对进化 树进行可视化展示； 步骤四： 对三种蔬菜的选择压力进行计算分析， 计算非用义 替换Ka和同义 替换Ks； 步骤五： 以津南实芹为实验材料， 对津南实芹进行培养， 培养至60d时， 选取长势一致的 健康植株， 分组进 行不同逆境条件处理， 高、 低温处理通过将生长 室温度分别调整为38℃和 4℃进行， 处理后分别于1、 2、 4、 8和24h后取植株叶片， 利用液氮速冻后于 ‑80℃冰箱中保存 备用； 步骤六： 芹菜RNA提取试剂盒提取芹菜总RNA， 然后按照反转录试剂盒操作说明进行 cDNA的反转录； 步骤七： 采用Bio ‑RadIQ5荧光定量PCR系统， 在96孔板中进行荧光定量PCR反应， 选用芹 菜Actin作内参基因， 采用2‑Δ ΔCt方法计算基因的相对表达量。 2.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述步骤一中， 将LCY基因的 隐马尔可夫模型作为输入文件进 行检索， 鉴定拟南芥、 芹菜、 香菜和胡 萝卜中的LCY氨基酸序列， 并使用TBt ools从基因组中提取鉴定到的基因， 将 获得的序列放入NCBI数据库进行Blast检测， 并命名。 3.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述步骤三中， 对三种蔬菜的分析是为了研究LCY基因在三个伞形科 蔬菜作物的进 化关系。 4.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述步骤三中， 确 定最佳模型时， 利用IQTREE软件使用最大似然法构建进化树， 重 复次数设置为10 00， 其它参数不变。 5.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述 步骤四中， 通过 Ka和Ks的比值可以同来衡量选择压力三种蔬菜的选择压力。 6.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述步骤 四中， 先用ParaAT2.0软件对三个伞形科植物LCY基因的编码序列和核苷 酸序列进行比对， 然后利用KaKs_calculator2.0软件计算Ka、 Ks和Ka/Ks值， 模型设置为NG 模型， 当Ka/Ks＞1时， 表示该基因对受到了正向选择， 当Ka/Ks＜1时， 表示该基因对受到了 负选择， 当Ka/Ks＝1时， 表示该基因对受到 了中性选择。 7.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115011722 A 2征在于： 所述 步骤五中， 选取长势一 致的健康植株时， 以蒸馏水喷灌作为对照组。 8.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述步骤五中， 高、 低温处理的同时以200g/L的PEG6000溶液和200mmol/L的NaCl溶 液浇灌芹菜植株模拟干旱和盐胁迫。 9.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述 步骤七中， 选用的芹菜荧 光定量PCR总体系为20 μL。 10.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε ‑环化酶基因克隆及功能鉴定方法， 其特 征在于： 所述步骤七中， 每个PCR反应体系中包含7.2 μLddH2O、 10 μLSYBRGreenI mix、 0.4 μL的 正、 反向引物和2.0 μLcDNA模板 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115011722 A 3