(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210724572.9 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市 市南区南海路7 号 (72)发明人 宋浩　胡志　张涛　石璞　杨美洁　 周骢　胡朋朋　陈婕　 (74)专利代理 机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 210 02 专利代理师 李颖 (51)Int.Cl. C12N 5/07(2010.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01)C12R 1/91(2006.01) (54)发明名称 一种脉红螺 胚胎细胞系的构建与鉴定方法 (57)摘要 本发明属于海洋贝类的细胞培养技术领域， 具体涉及到一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴 定方法。 将脉红螺胚胎细胞于细胞完全培养基中 原代培养， 再将原代培养后 细胞每7‑10天以一 分 为二的比例进行传代培养， 直至细胞性状稳定， 进而建立脉红螺胚胎细胞系。 本发 明构建的脉红 螺胚胎细胞系为国内外首个可连续传代的海水 螺类细胞系， 在生理、 分子遗传学 以及发育生物 学领域具有广泛的研究及应用价 值。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图3页 CN 115044532 A 2022.09.13 CN 115044532 A 1.一种脉红螺胚胎细胞系的构建方法， 其特征在于： 将脉红螺胚胎细胞于细胞完全培 养基中原代培养， 再将原代培养后细胞每7 ‑10天以一分为二的比例进行传代培养， 直至细 胞性状稳定， 进 而建立脉红螺胚胎细胞系。 2.按权利要求1所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法， 其特征在于： 所述细胞完全培养 基为以L15为基础培养基， 向基础培养基中添加其体积10％的胎牛血清， 其体积5％的青链 霉素混合液， 其体积40％的一螺层卵袋提取 液。 3.按权利要求2所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法， 其特征在于： 所述卵袋提取液为 从脉红螺一螺层卵袋中抽取 营养液， 提取后进行离心、 过 滤， 待用， 置 于‑80℃保存。 4.按权利要求2所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法， 其特征在于： 所述原代培养为将 脉红螺胚胎细胞按50,000 ‑100,000个/ml接种量于细胞完全培养基中于25℃细胞培养箱， 进行原代培养直至细胞密度为100,000 ‑200,000个/ml； 其中， 脉红螺胚胎细胞为将消 毒后 脉红螺产卵1 天的卵袋， 收集 其胚胎研磨， 待用。 5.按权利要求4所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法， 其特征在于： 所述脉红螺胚胎细 胞为取脉红螺产卵1天的卵袋浸泡在 超纯水浸泡5 ‑10min； 再于体积百分含量为70％的酒精 水溶液浸泡5 ‑10min； 将消毒好的卵袋剪开， 胚胎经无菌PBS缓冲溶液洗涤， 洗涤后收集其胚 胎， 磨碎胚胎过 滤得到细胞 滤液， 待用。 6.按权利要求1所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法， 其特征在于： 所述传代培养为待 原代培养的细胞密度达到100,000 ‑200,000个/ml时,以一分为二的比例进行传代， 每7 ‑10 天传代一次， 按原 代培养条件进行传代培 养， 直至培养至细胞性状稳定 。 7.一种权利要求1构建获得脉红螺胚胎细胞系的鉴定方法， 其特征在于： 以脉红螺胚胎 细胞系DNA 为模板， 分别采用贝类18S和COI引物， 进行PCR扩增， 分别扩增的脉红螺胚胎细胞 的18S基因片段和COI基因片段， 待扩增的18S基因片段产物中带有970bp条带， 扩增的COI基 因片段产物中带有721bp条 带， 同时存在这两个片段即为脉红螺胚胎细胞。 8.按权利要求7所述的鉴定方法， 其特征在于： 所述18S引物序列为： 18S ‑1F： TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG， 18S ‑5R： CTTGGCAAATGCTTTCGC； 所述COI引物序列为： LCO1490： GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG， HCO2198： TA AACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。 9.按权利要求7所述的鉴定方法， 其特征在于： 所述PCR扩增反应条件均为94℃预变性 5min， 然后94℃变性3 0s， 52℃退火3 0s， 72℃延伸40s， 3 5个循环后， 72℃延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044532 A 2一种脉红螺胚胎细胞系 的构建与鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明属于海洋贝类的细胞培养技术领域， 具体涉及到一种脉红螺胚胎细胞系的 构建与鉴定方法。 背景技术 [0002]细胞培养是细胞工程技术的重要内容， 已发展成为生物、 医学研究与应用中广泛 采用的技术方法。 水生动物细胞培养的研究晚于哺乳动物， 且主要集中在鱼类， 全世界范围 内已建立超过700多种鱼类细胞系。 然而在水生无脊椎动物中， 除唯一一个淡水水生无脊椎 动物细胞系――光滑双脐螺(Bromphalaria  glabrata)担轮幼虫细胞系(Bge)建立的报道 外， 未见其他永生性细胞系成功建立的报道。 许多学者尝试优化培养基， 选取不同发育阶 段、 组织材料来建立海洋贝类细胞系， 但效果并不明显。 建立海洋贝类细胞系依然 是一项充 满挑战性和困难性的工作。 [0003]脉红螺Rapana  venosa， 隶属于软体动物门(Mollusca)、 腹足纲(Gastropo da)、 前 鳃亚纲(Prosobranchia)、 新腹足目(Neogastropoda)、 骨螺科(Muricidae)、 红螺属 (Rapana)， 是典型的肉食性螺类， 在我国渤海、 黄海和东海以及日本、 朝鲜、 俄罗斯 沿海等地 均有分布， 具有很高的经济价 值和药用价 值， 畅销国内外市场。 发明内容 [0004]对于现有技术中所存在的问题， 本发明的目的是提供一种脉红螺胚胎细胞系的构 建与鉴定方法。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用技 术方案为： [0006]一种脉红螺胚胎细胞系的构建方法， 其特征在于： 将脉红螺胚胎细胞于细胞完全 培养基中原代培养， 再将原代培养后细胞每7 ‑10天以一分为二的比例进行传代培养， 直至 细胞性状稳定(大致20代左右)， 进 而建立脉红螺胚胎细胞系。 [0007]所述细胞完全培养基为以L15为基础培养基， 向基础培养基中添加其体积10％的 胎牛血清， 其体积5％的青链霉素混合液， 其体积40％的一螺层卵袋提取 液。 [0008]所述卵袋提取液为从脉红螺一螺层卵袋中抽取营养液， 提取后进行离心、 过滤， 待 用， 置于‑80℃保存。 [0009]其中， 脉红螺一螺层卵袋为脉红螺幼虫发育 到一螺层幼虫时期的卵袋。 [0010]所述原代培养为将脉红螺胚胎细胞按50,000 ‑100,000个/ml接种量于细胞完全培 养基中于25℃细胞培养箱， 进行原代培养直至细胞密度为100,000 ‑200,000个/ml； 其中， 脉 红螺胚胎细胞为将消毒后脉红螺产卵1 天的卵袋， 收集 其胚胎研磨， 待用。 [0011]所述脉红螺胚胎细胞为取脉红螺产卵1天的卵袋浸泡在超纯水浸泡5 ‑10min； 再于 体积百分含量为70％的酒精水溶液浸泡5 ‑10min。 将消毒好的卵袋剪开， 胚胎经无菌PBS缓 冲溶液洗涤， 洗涤后收集其胚胎， 磨碎胚胎过滤得到细胞滤液(在过滤网上研磨， 所述过滤 网孔径为 40 μm)， 待用。说　明　书 1/3 页 3 CN 115044532 A 3