(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210678173.3 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 杭州奥明 医学检验实验室有限公司 地址 310000 浙江省杭州市钱塘新区和享 科技中心 21幢309室 (72)发明人 童云广　张竞闻　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 一种胰腺癌相关基因甲基化检测的方法， 试 剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种胰腺癌相关基因甲基化 的检测方法及试剂盒。 本发明通过设计和制备特 异性甲基化检测的引物和探针扩增经重硫酸盐 转化纯化的Bis  DNA， 结合科学合理的实时荧光 PCR反应体系优化， 根据ADAMTS1基因、 BNC1基因 与ACTB基因PCR扩增结果的相对 荧光CT值来确定 待测样本的平均甲基化值， 实现区分早期胰腺癌 患者， 存在潜在胰腺癌风险的患者和非胰腺癌患 者的早诊早治目的。 本发明的试剂盒对早期胰腺 癌患者检出率高达100%， 特异性为100%， 不仅可 以避免患者反复筛查和盲目用药， 而且可以显著 降低不必要的临床费用， 为病患和社会带来临床 检测效益。 权利要求书2页 说明书20页 序列表2页 附图1页 CN 115094138 A 2022.09.23 CN 115094138 A 1.一种胰腺癌相关基因甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法包括以下步骤：   第一步， 从患者血液或组织中提取DNA样 本； 第二步， 将第一步提取得到的DNA样 本进行重硫 酸盐转化反应， 然后纯化得到Bis  DNA； 第三步， 采用PCR扩增液对将第二步获得的产物进行 探针荧光定量PCR扩增， 所述PCR  扩增液包括： ADAMTS1正向引物、 ADAMTS1反向引物、 ADAMTS1检测探针、 BNC1正向引物、 BNC1反向引物、 BNC1检测探针、 A CTB正向引物、 A CTB 反向 引物、 ACTB检测 探针、 脱氧核糖核苷三磷酸和无核酸酶水； 第四步， 根据第三步获得的探针 荧光定量PCR扩增的结果确定患者DNA样 本的甲基化值， 当患者DNA样 本中的ADAMTS1和BNC1 相对于ACTB的基因甲基化值的平均值大于一定值时， 为早期胰腺癌患者； 当患者DNA样 本中 的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化值的平均值小于一定值时， 为非胰腺癌患者； 当 患者DNA样本中的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化值的平均值介于早期胰腺癌患 者和非胰腺癌患者甲基化值平均值之间， 说明患者存在潜在的胰腺癌风险， 需要定期检测 ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化 值变化， 避免病情恶化。 2.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第一步的DNA样 本的提取具体包括以下步骤： 先将血液离心后移除上清液， 随后在所获得的 血浆样本中依次加入缓冲液和蛋白酶K进 行混匀和温育， 然后再加入磁珠混匀和旋转孵育， 得到样本DNA； 所述离心的时间为1 ‑20分钟； 所述离心的转速为2500 ‑15000rpm； 所述血浆样 本、 蛋白酶K和磁珠的体积比为 （140 ‑120） : （3‑1） : （2‑0.5） ； 所述温育的时间为7 ‑15分钟， 所 述温育的温度为55 ‑65摄氏度； 所述旋转孵育的时间为5 ‑15分钟； 所述旋转孵育的温度为 20‑30摄氏度。 3.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第二步的重硫酸盐的转化反应具体包括以下步骤： 先将第一步提取得到的DNA样本、 亚硫酸 氢钠溶液、 DNA凝胶加样缓冲液和水混合， 随后升温至75 ‑90摄氏度反应5 ‑10分钟， 然后降温 至40‑55摄氏度反应1.5 ‑2.5小时， 最后 在5‑15摄氏度保持2 ‑4小时； 所述DNA样本、 亚硫酸氢 钠溶液、 DNA凝胶加样缓冲液和水的体积比为1:(75 ‑85):(25‑30):1； 所述亚硫酸氢钠溶液 的质量浓度为3 5‑45wt％。 4.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第三步的探针荧光定量PCR的扩增具体包括以下步骤： 先将第二步重硫酸盐转化反应得到 的反应液倒入UNIQ ‑10柱， 随后依次通过缓冲液洗涤、 脱磺化液脱磺化， 然后用洗脱液进行 洗脱， 最后获得纯化的Bis  DNA； 所述 缓冲液的组成为三羟甲基氨基甲烷、 氯化钠、 乙二胺四 乙酸钠、 乙醇和双蒸 水； 所述磺化液的组成为三羟甲基氨基甲烷、 氯化钠、 氢氧化钠、 乙醇和 双蒸水。 5.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第三步中ADAMTS1正向引物的序列为5 ´‑TTAGGGAGTTGAGTAAGAC ‑3´， 所述ADAMTS1反向引物 的序列为5 ´‑TAAAATAAGCTATAAATAACTAAACG ‑3´， 所述ADAMTS1检测探针的序列为5 ´‑   AGATAAAACGCGACGCG GGGTTAG‑3´。 6.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第三步中BNC1正向引物的序列为5 ´‑TTAGGAGGTAAAGATTGATGT ‑3´， 所述BNC1反 向引物的序 列为5´‑CCAATAACAATAAATCCCTAAACAA ‑3´， 所述BNC1检测探针的序列为5 ´‑   AGTTAAGGCGCGAAGCATTTTAG‑3´。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115094138 A 27.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第三步中ACTB正向引物的序列为5 ´‑GGAATGGCCTTAGGTCATTCGATTT ‑3´； 所述ACTB反向引物 的序列为5 ´‑ATGATGTAACCCACCTTACGGTCACC ‑3´； 所述ACTB检测探针的序列为5 ´‑   CCATGTAACCGGACCCTTACGGCCT‑3´。 8.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第三步中所述PCR扩增液的具体组成为： 0.12 ‑0.27微摩尔每升的ADAMTS1正向引物、 0.12 ‑ 0.27微摩尔每升的ADAMTS1反向引物、 0.13 ‑0.44微摩尔每升的ADAMTS1检测探针、 0.13 ‑ 0.44微摩尔每升的BNC1正向引物、 0.13 ‑0.44微摩尔每升的BNC1反 向引物、 0.13 ‑0.44微摩 尔每升的BNC1检测探针、 0.12 ‑0.27微摩尔每升的ACTB正向引物、 0.12 ‑0.27微摩尔每升的   ACTB反向引物、 0.13 ‑0.44微摩尔每升的ACTB检测探针、 0.13 ‑0.44微摩尔每升的脱氧核糖 核苷三磷酸， 及无核酸酶水。 9.根据权利要求1中所述胰腺癌相关基因 甲基化的检测方法， 其特征在于， 所述步骤中 第二步所述重硫酸盐转化反应后纯化产物和第三步中所述PCR扩增液的体积比为1: （1.3 ‑ 3.6） ； 所述第三步中所述PCR扩增的反应条件为： 88 ‑92摄氏度预变性6 ‑8分钟； 88 ‑92摄氏度 变性8‑18秒， 50‑67摄氏度退火延伸16 ‑48秒， 共40 ‑55个循环， 4摄氏度保存。 10.一种胰腺癌相关基因甲基化检测的荧光定量试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求1 所述的PCR扩增液、 聚合酶、 阴性对照样品以及阳性对照样品。 11.根据权利要求11所述的一种胰腺癌相关基因甲基化检测的荧光定量试剂盒， 其特 征在于： 所述PCR扩增液原料体积与数量分别为0.90毫升和2份。 12.根据权利要求11所述的一种胰腺癌相关基因甲基化检测的荧光定量试剂盒， 其特 征在于， 所述聚合酶为T aq DNA 聚合酶， 所述T aq DNA 聚合酶的体积与数量分别 为80微升 和1份。 13. 根据权利要求11所述的一种胰腺癌相关基因甲基化检测的荧光定量试剂 盒， 其特 征在于， 所述阴性对照样品包括  WBC DNA、 BSA和1xTE  Buffer， 且上述原料体积与数量分别 为3.0毫升和3管。 14.根据权利要求11所述的一种胰腺癌相关基因甲基化检测的荧光定量试剂盒， 其特 征在于， 其特征在于： 所述阳性对照样品包括  细胞株DNA、 WBCDNA、 BSA和1xTE， 且上述原料 体积与数量分别为3.0毫升和3管。 15.根据权利要求1所述的一种 胰腺癌相关基因甲基化检测的荧光定量试剂盒， 其特征 在于， 所述阴性对照样品包括  3种， 分别命名为阴性参考品AMYINX1 ‑AMYINX3， 阴性参考品 AMYINX1‑AMYINX3为一定DNA浓度不同的ADA MTS1和 BNC1均为阴性的参考品； 所述阴性参考 品的ADAMTS1和BNC1相对于ACTB的基因甲基化 值的平均值小于 0.5。 16.根据权利要求1所述的一种 胰腺癌相关基因甲基化检测的荧光定量试剂盒， 其特征 在于， 所述阳性对照样品阳性参考品包括9种， 分别命名为阳性参考品AMYANX1 ‑AMYA