(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210642488.2 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 北京化工大 学 地址 100029 北京市朝阳区北三环东路15 号北京化工大 学材料科学与工程学院 (72)发明人 杨昭　喻长远　史梦然　梁有沣　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 专利代理师 巴晓艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种肝细胞癌筛 选检测方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种肝细胞癌筛选检测方法 及其应用， 以特征基因TP53I3为肝细胞癌标志 物， 通过检测肝细胞癌组织样本中特征基因 TP53I3的表达量实现筛选检测肝细胞癌， 并将 对 该特征基因TP53I3的检测应用于一种肝细胞癌 筛选检测与预后评估试剂盒， 所述试剂盒包括特 征基因TP53I3基因的引物组分以及所采用检测 方法对应的辅助试剂， 该试剂盒通过检测特征基 因TP53I3基因的表达量， 应用于肝细胞癌筛选检 测与预后评估， 本发明公开了一种新的肝细胞癌 标志物： 特征基因TP53I3， 在肝细胞癌辅助诊断、 预后评估和治 疗领域具有重要的应用价 值。 权利要求书1页 说明书22页 序列表2页 附图7页 CN 115074421 A 2022.09.20 CN 115074421 A 1.一种肝细胞癌筛选检测方法， 其特征在于， 所述方法是以特征基因TP53I3为肝细胞 癌标志物， 通过检测肝细胞癌组织样 本中所述特征基因TP53I3的表达量 实现筛选检测肝细 胞癌。 2.根据权利要求1所述的一种肝细胞癌筛选检测方法， 其特征在于， 所述方法包括以下 步骤： S1、 选取肝细胞癌样品， 所述样品包括组织、 细胞和血 液； S2、 提取总RNA； S3、 总RNA反转录合成cDNA； S4、 加入特征基因TP53I3的特异性引物， 以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩 增； S5、 荧光定量PCR检测肝细 胞癌组织样本中TP53I3的表达量， 起始点表示产物聚集的对 数期开始， 该期产物的荧 光信号呈指数增长， 检测仪将此点定义 为Ct值； S6、 根据目的基因与内参基因Ct值之差ΔCt可以预测靶基因产物起始浓度， 实现对肝 细胞癌的筛 选检测。 3.根据权利要求2所述的一种肝细胞癌筛选检测方法， 其特征在于， S4所述特异性引物 为： TP53I3‑F:5’ ‑AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP5 3I3‑R:5’ ‑TTCGGTCACTGGGTAGATTC。 4.根据权利要求2所述的一种肝细胞癌筛选检测方法， 其特征在于， S6所述内参基因为 GAPDH， S6所述预测靶基因产物 起始浓度的方法为： 在PCR反应条件相同的情况下， ΔCt值越 低， 靶基因的起始浓度越大。 5.一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒采用权利要求 1‑4任一项所述方法进行肝细胞癌筛 选和检测。 6.根据权利要求5所述的一种肝细胞癌筛选检测与 预后评估试剂 盒， 其特征在于， 所述 试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒， 所述试剂盒包括特征基因TP53I3的特异性引物、 PCR反 应液和荧 光染料， 所述试剂盒用于肝细胞癌筛 选检测及预后评估。 7.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与 预后评估试剂 盒， 其特征在于， 所述 特异性引物为： TP53I3‑F:5’ ‑AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP5 3I3‑R:5’ ‑TTCGGTCACTGGGTAGATTC。 8.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与 预后评估试剂 盒， 其特征在于， 所述 PCR反应液为荧光定 量PCR反应液， 所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、 Mg2+、 Taq酶及 PCR缓冲 液， 所述Taq酶为热启动酶。 9.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与 预后评估试剂 盒， 其特征在于， 所述 荧光染料为SYBR  GreenⅡ。 10.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒， 其特征在于， 所 述特异性引物适用于SYBR  Green、 TaqMan探针、 分子信标、 双杂交探针、 复合探针的检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074421 A 2一种肝细胞癌筛选检测方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤分子生物学领域， 特别涉及一种肝细胞癌筛选检测方法及其应 用。 背景技术 [0002]肝癌是发生于肝细胞的恶性肿瘤。 2021年CA杂志报道全球肝癌约有90.71万新发 病例和82.17万死亡病例死亡率为8.3％， 在所有肿瘤类型中位列第三。 根据起源， 肝癌可分 为原发性和继发性两种。 原发性肝癌主要分为肝细胞癌(75 ‑85％)和肝内胆管癌(10 ‑15％) 两类。 致瘤机制不明确、 缺乏早期诊断标志物和非特异性治疗手段是肝细胞癌的最大特点， 有效的治疗很大程度上依赖 于对肝细胞癌的早期发现和治疗。 [0003]肝细胞癌通常在长期患有肝病的患者中发生， 大部分患者没有症状， 由筛查而被 诊断。 筛查分成高危人群筛查和肿瘤本身针对性的筛查。 高危人群筛查是针对长期慢性乙 肝病人、 有肝硬化的病人、 患有丙肝的病人等这些肝癌的易 发高危人群的筛查。 另一部 分需 要重点关注的人群是那些肝脏已经出现了可疑的病变， 但是又没有明确是肿瘤的病 人。 肝 细胞癌的针对性检查主要分为影像学检查和实验室检查。 影像学检查最常用的是体表超声 这种经济实用的方法， 但它对检查医生的经验和水平以及 对设备要求比较高。 另外， 必 要的 时候还会采用增强CT或者核磁等。 对于实验室检查， 主要包括肝功能检查、 血常规检查以及 肿瘤标志 物检查等。 [0004]目前临床上正在使用的肝细胞癌相关的肿瘤标志物包括甲胎蛋白(A FP)和异常凝 血酶原(DCP)等,但尚无 单一标志 物可诊断肝细胞癌。 [0005]AFP是一种糖蛋白， 正常情况下这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞， 胎儿出生约两周 后AFP从血液中消失， 因此正常人血清 中AFP的含量不到20ng/mL。 但当肝细胞发生癌变时， 又恢复了产生这种蛋白质的功能。 所以AFP是迄今为止最广泛用于HCC筛查、 早期诊断以及 疗效和预后评估的生物标志物。 使用常用的HCC阳性截止值(AFP水平≥20ng/mL)时， AFP的 敏感度为41 ‑65％， 特异度为80 ‑94％。 但AFP阴性(<20ng/mL)率在52％的小HCC(<3cm)患 者 及53.5％的TNM  I期患者中发现， 表明近一半的HCC患者AFP阴性， 尤其是早期和小HCC， 作为 肝细胞癌的早期筛查指标不理想 。 [0006]DCP在肝脏合成， 当维生素K缺乏或服用某些抗凝药物时异常升高， DCP是肝脏在合 成凝血酶原过程中前体羧化不完全所致， 所以全称脱 ‑γ‑羧基凝血酶原。 当肝细胞发生癌 变、 羧化酶基因表达水平下降或者肝细胞内存在羧化 酶抑制剂时患者血清D CP含量升高， 是 伴随肝癌特异产生的异常凝血酶原。 使用常用的HCC阳性截止值(DCP≥40mAU/mL)诊断早期 肝细胞癌的灵敏度和特异性分别为64％和89％， 准确度为86.3％。 但患者维生素K缺乏、 饮 酒或者服用华法林等 抗凝剂均可导 致DCP的异常升高。 [0007]因此， 研究开发一种高特异性和高灵敏性的标志物用于肝细胞癌的诊断， 对于肝 细胞癌的诊断和治疗具有重要意 义。说　明　书 1/22 页 3 CN 115074421 A 3