(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210696706.0 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 南方海洋科学与工程广东省实验室 （湛江） 地址 524006 广东省湛江市霞山区文体路 一号 （图书馆） (72)发明人 赵娜　张博　朱春华　邓秋霞　 朱旭枫　黄洋　王秋梅　茹笑影　 胡琴　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 罗新 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) G16B 20/30(2019.01) (54)发明名称 一种用于高体鰤性别检测的miRNA及试剂盒 与应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于高体鰤性别检测的 miRNA及试剂盒与应用。 所述用于高体鰤性别检 测的miRNA， 其核 酸序列如Seq  ID No.1所示或为 Seq ID No.1中所示的核 酸序列经修饰、 取代、 缺 失或添加至少一个碱基获得的核酸序列。 所述用 于高体鰤性别检测的miRNA， 能够区分高体鰤雌 鱼和高体鰤雄鱼， 是具有特异性表达的性别标 签。 所述用于高体鰤性别检测的miRNA， 在高体鰤 雄鱼样本中的表达量较高， 而在高体鰤雌鱼样本 中的表达量较低。 依据miRNA 定量分析结果， 进行 高体鰤雌 鱼和高体鰤雄鱼的判定 。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 115161320 A 2022.10.11 CN 115161320 A 1.一种miRNA， 其特征在于： 所述miRNA的核酸序列如Seq  ID No.1所示或为Seq  ID  No.1中所示的核酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加至少一个碱基获得的核酸序列。 2.与权利要求1所述的miRNA相关的生物材料， 其特征在于： 所述生物材料为1)～4)中 任一种： 1)权利要求1所述的miRNA前体； 2)权利要求1所述的miRNA模拟物； 3)编码权利要求1所述的miRNA或1)中所述的miRNA前体的DNA分子； 4)含有3)中所述的DNA分子的表达盒、 重组载体或转基因细胞。 3.用于扩增如权利要求1所述的miRNA的引物组。 4.根据权利要求3所述的引物组， 其特征在于： 所述引物组包括正向引物和反向引物， 其中： 正向引物序列如Seq  ID No.2所示； 反向引物序列如Seq  ID No.3所示。 5.一种试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1所述的miRNA、 权利要求2所述 的生物材 料或， 权利要求3或4所述的引物组。 6.根据权利 要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中还包括 内参基因oni ‑let‑ 7a的定量检测引物、 内参基因逆转录引物和PCR荧光定量试剂； 优选地， 所述内参基因oni ‑ let‑7a的定量检测引物包括oni ‑let‑7a的引物的逆转录引物和oni ‑let‑7a的引物； 更优选 地， 所述oni‑let‑7a的引物的逆转录引物的核酸序列如Seq  ID No.4所示。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于： 所述oni ‑let‑7a的引物包括正向引物和 反向引物， 其中： 正向引物序列如Seq  ID No.5所示； 反向引物序列如Seq  ID No.6所示。 8.权利要求1所述的miRNA、 权利 要求2所述的生物材料、 权利 要求3或4所述的引物组或 权利要求5 ‑7任一项所述的试剂盒在制备高体鰤性别检测试剂中的应用。 9.权利要求1所述的miRNA、 权利要求2所述的生物材料、 权利要求3或4所述的引物组， 或权利要求5 ‑7任一项所述的试剂盒在高体鰤养殖中的应用。 10.一种用于高体鰤性别检测的miRNA的筛 选方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 对高体鰤血清外泌体small  RNA进行测序、 过滤与分析， 筛选出高体鰤性别检测的 microRNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115161320 A 2一种用于高体鰤性别检测的miRNA及 试剂盒与应用 技术领域 [0001]本发明涉及鱼类生物技术相关技术领域， 尤其是涉及一种用于高体鰤性别检测的 miRNA及试剂盒与应用。 背景技术 [0002]高体鰤(Seriola  dumerili)是一种肉质好， 生长速度快， 营养价值高的世界性深 远海经济 鱼类。 高体鰤是雌雄异体鱼类， 但表型没有显著的性别二态性， 因此难以从鱼体表 面直接判断鱼的性别。 此外， 在人工养殖条件下， 高体鰤表现出严重的生殖功能障碍， 由于 高体鰤性别鉴定困难， 极大影响了高体鰤的催产繁育工作， 严重制约了高体鰤的工厂化养 殖。 [0003]鱼类性别鉴定有多种方法： 生理解剖观察、 性腺切片、 性腺细胞观察、 雌性特异分 子标记等。 有些 方法虽然简单易行， 但是 结果并不十分准确， 有些 方法还不得不剖杀鱼。 [0004]因此， 开发鉴定高体鰤雌鱼和雄鱼的方法不仅具有理论意义， 而且也具有生产价 值和市场价 值。 发明内容 [0005]本发明所要解决的第一个技 术问题是： [0006]提供一种miRNA。 所述miRNAs具有在高体鰤雌鱼和雄鱼 中显著差异表达的特点， 是 特异的分子识别标记。 [0007]本发明所要解决的第二个技 术问题是： [0008]提供一种所述miRNA相关的生物材 料。 [0009]本发明所要解决的第三个技 术问题是： [0010]提供一种用于高体鰤性别检测的特异性引物组。 [0011]本发明所要解决的第四个技 术问题是： [0012]提供一种高体鰤性别检测试剂盒。 [0013]本发明所要解决的第五个技 术问题是： [0014]提供一种用于高体鰤性别检测的miRNA的筛 选方法。 [0015]为了解决所述第一个技 术问题， 本发明采用的技 术方案为： [0016]一种miRNA， 所述mi RNA的核酸序列如Seq  ID No.1所示或为Seq  ID No.1中所示的 核酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加至少一个碱基获得的核酸序列。 [0017]所述miRNA性别标签为dre ‑miR‑133b‑3p。 [0018]所述用于高体鰤性别检测的miRNA， 在高体鰤雄鱼样本中的表达量较高， 而在高体 鰤雌鱼样本中的表达量较低。 依据mi RNA定量分析结果， 进 行高体鰤雌鱼和高体鰤 雄鱼的判 定。 [0019]根据本发明的一种实施方式， 本发明的高体鰤性别检测的miRNA， 来源于1龄左右 的高体鰤的血清外泌体， 需要注意的是筛选出的性别标记是转录水平的mi RNA标志物， 具有说　明　书 1/9 页 3 CN 115161320 A 3