(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211069052.5 (22)申请日 2022.09.01 (71)申请人 广州海关技 术中心 地址 510000 广东省广州市珠 江新城花城 大道66号广东国检大厦B座 (72)发明人 梅明珠　陈茹　吴晓薇　刘志玲　 林志雄　段燕喻　 (74)专利代理 机构 昆明鸿昊知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 53211 专利代理师 陈芃綦 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的 RT-RAA扩增引物探 针、 试剂盒和方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于马病毒性动脉炎病 毒核酸检测的RT ‑RAA扩增引物 探针、 试剂盒和方 法， 涉及病毒检测领域， 解决了现有技术中检测 方法存在灵敏度和特异性较低、 可靠性差、 操作 繁琐以及需要昂贵设备的问题。 本发 明的引物探 针 ， 引物序列为 ： 上游引物 ： EAV ‑F ： 5’‑ GTCAAGACGATCACGTCCGCAGGCCGCCTC ‑3’SEQ ID  N o . 1 ；下 游 引 物 ：E A V ‑R ：5’‑ TAGCCTGAGTGGGTTGTGCGGGCGGTTTGCG ‑3’SEQ ID  N o . 2 ；探 针 序 列 为 ：E A V ‑P ：5’‑ ACAGCCTACAAGCTACAA TGACCTACTGCGTA TTGGTCAGA TGCGGG‑3’SEQ ID No.3； 本发明用于马病毒性动 脉炎病毒核 酸检测的RT ‑RAA扩增引物探针、 试剂 盒和方法， 具有灵敏度高、 特异性强、 可视化、 操 作方法简单、 无需昂贵设备等优点， 适合资源有 限的基层 及口岸现场动物疫病的检测。 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 CN 115261519 A 2022.11.01 CN 115261519 A 1.一种用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的RT ‑RAA扩增引物探针， 其特征在于， 引物 序列为： 上游引物： EAV‑F： 5’ ‑GTCAAGACGATCACGTC CGCAGGCCGCCTC‑3’SEQ ID No.1； 下游引物： EAV‑R： 5’ ‑TAGCCTGAGTGGGTTGTGCGGGCGGTTTGCG‑3’SEQ ID No.2； 探针序列为： EAV‑P： 5’ ‑ACAGCCTACAAGCTACAATGACCTACTGCGTAT TGGTCAGATGCG GG‑3’SEQ ID No.3； 所述探针共有四个修饰位点， 其中， 距离5 ’端的第30～35个碱基中的任意一个位置标 记一个四氢呋喃THF； THF位点的上游标记一个荧光基团FAM， THF位点的下游标记一个淬灭 基团BHQ， 并且相邻两个标记基团间的间距为1～4个碱基； 3 ’端标记一个修饰基团C3 ‑ spacer。 2.一种用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒为重组 酶介导扩增试剂盒， 并且所述试剂盒包括引物混合液、 探针、 马病毒性动脉炎病毒 阳性对照 样品、 马病毒性动脉炎病毒阴性对照样 品、 RT‑RAA干粉试剂、 水解缓冲液和醋酸镁溶液， 其 中， 引物混合液中的引物为权利要求1所述的用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的RT ‑RAA 扩增引物， 探针为权利要求1所述的用于马病毒性动脉炎病毒 核酸检测的RT ‑RAA探针。 3.根据权利要求2所述的用于马病 毒性动脉炎病 毒核酸检测的试剂 盒， 其特征在于， 试 剂盒中各组分的用量分别 为： 2 μL的上游引物、 2 μL的下游引物、 0.3 μL的探针、 5 μL的马病毒 性动脉炎病毒阳性对照样品、 5 μL的马病毒性动脉炎病毒阴性对照样品、 50 μL的RT ‑RAA干粉 试剂、 29.4 μL的水解缓冲液和2.5 μL的醋酸镁溶 液。 4.根据权利要求3所述的用于马病 毒性动脉炎病 毒核酸检测的试剂 盒， 其特征在于， 引 物探针中， 上游引物和下游引物的摩尔比为1∶ 1。 5.根据权利要求3或4所述的用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的试剂盒， 其特征在 于， 上游引物的浓度为10 μmo l/L， 下游引物的浓度为10 μmo l/L， 探针的浓度为10 μmo l/L。 6.根据权利要求2所述的用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的试剂盒， 其特征在于， RT‑RAA干粉试剂包括如下组分： dNTPs、 单链结合蛋 白、 recA重组酶蛋 白、 大肠杆菌DNA聚合 酶、 二硫苏糖醇、 丙酮酸激酶、 DNA解旋酶gp41蛋白和逆转录酶。 7.根据权利要求6所述的用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的试剂盒， 其特征在于， RT‑RAA干粉试剂包括如下含量的组分： 1 ‑5mmol/L的dNTPs、 200 ‑1000ng/μL的单链结合蛋 白、 100‑500ng/ μL的recA 重组酶蛋白、 50 ‑200ng/ μL的大肠杆菌DNA聚合酶、 5 ‑15mmol/L的二 硫苏糖醇、 500 ‑1500ng/ μL的丙酮酸激酶、 50 ‑200ng/ μL的DNA解旋酶gp41蛋白和10 ‑100ng/ μ L的逆转录酶。 8.根据权利要求2所述的用于马病 毒性动脉炎病 毒核酸检测的试剂 盒， 其特征在于， 水 解缓冲液为聚乙二醇溶 液， 并且聚乙二醇溶 液的质量分数为20％。 9.根据权利要求2所述的用于马病 毒性动脉炎病 毒核酸检测的试剂 盒， 其特征在于， 醋 酸镁溶液的浓度为280m mol/L。 10.一种利用权利要求2至9中任一项所述的试剂盒进行马病 毒性动脉炎病毒核酸检测权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261519 A 2的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤1： 在装有RT ‑RAA干粉试剂的反应干粉管中加入水解缓冲液、 引物混合液和探针， 然后于样品检测管、 阳性对照管和阴性对照管中分别加入待检样品、 马病毒性动脉炎病毒 阳性对照 样品、 马病毒性动脉炎病毒 阴性对照 样品， 最后加入醋酸镁 溶液， 加完后立即上下 颠倒反应管使之充分 混匀， 然后瞬离， 最后放入荧 光检测设备； 步骤2： 荧 光检测程序设置为： 恒温42℃反应20mi n， 每30s采集一次FAM通道的荧 光值； 步骤3： 结果判读： 样品检测管 无扩增曲线， 表明检测样品中无马病毒性动脉炎病毒 核酸； 样品检测管 出现典型的扩增曲线， 表明检测样品中有马病毒性动脉炎病毒 核酸； 阴性对照管无扩增曲线， 阳性对照管有典型的扩增曲线， 视为此次试验有效； 如果阴性 对照管和阳性对照管不满足前述条件， 此次试验视为无效。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261519 A 3