(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211074096.7 (22)申请日 2022.09.02 (71)申请人 爱尔眼科医院集团股份有限公司长 沙爱尔眼科医院 地址 410000 湖南省长 沙市天心区芙蓉南 路一段18 8号 (72)发明人 赵阳　段宣初　 (74)专利代理 机构 东台金诚石专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 32482 专利代理师 刘杰伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检 测的引物与应用方法 (57)摘要 本发明涉及外科手术恢复技术领域， 尤其为 一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的 引 物 与 应 用 方 法 ，使 用 T R I z o l 试 剂 (InvitrogenLife  Technologies)从临床组织中 提取总RNA， 使用ArraystarRNAFlashLabeling   Kit(Arraystar， Rockv ille)对样本进行标记， 使 用AgilentSureHyb进行杂交实验， 然后洗涤芯 片 ， 洗 涤 后 的 芯 片 使 用 AgilentDNAMicroarrayScanner进行扫描， 应用 AgilentFeatureExtractionV11.0.1.1软件采集 芯 片 探 针 信 号 值 ， 使 用 AgilentGeneSpringGXv12.1软件进行芯片数据 均一 化处 理 和差 异分 析 ， 经 过 折 叠 倍 率 (foldchange， FC)筛选出所有差异表达的 lncRNAs和mRNAs， 筛选标准为倍数变化>1.5， P< 0.05。 本发明的试剂盒能够快速、 准确、 定量 lncRNANR_003923的表达量水平， 有效杜绝了常规荧光定量PCR重复性低、 准确性低的缺陷， 为青 光眼的早期诊断和预后评价提供了重要的检测 方法。 权利要求书3页 说明书7页 附图2页 CN 115386627 A 2022.11.25 CN 115386627 A 1.一种用于青光 眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法， 其特征在于： 包括 以下步骤： 步骤一： 根据lncRNANR_003923序列(NCB I登录号)和18S基 因序列(NCB I登录号)分别设 计特异性引物， 设计规则为： 引物长度不超 过25bp， TM值50℃ ‑70℃， GC含量40 ‑50％， 扩增产 物长度110bp， 设计序列为： lncRNANR_0 03923上游引物序列： AGATGCAGACGCTC CTGATG lncRNANR_0 03923下游引物序列： A ACACAGAAACCAGACGGCA 内参基因18 S上游引物序列： CAGC CACCCGAGATTGAGCA 内参基因18 S下游引物序列： TAGTAGCGACG GGCGGTGTG 步骤二： 差异表达lncRNA检测， 使用TRIzol试剂(InvitrogenLifeTechnologies)从临 床组织中提取总RNA， 使用ArraystarRNAFlashLabelingKit(Arraystar， Rockv ille)对样本 进行标记， 使用AgilentSureHyb进行杂交实验， 然后洗涤芯片， 洗涤后的芯片使用 AgilentDNAMicroarrayScanner进行扫描， 应用AgilentFeatureExtractionV11.0.1.1软件 采集芯片探针信号值， 使用AgilentGeneSpringGXv12.1软件进行芯片数据均一化处理和差 异分析， 经过折叠倍率(foldchange， FC)筛选 出所有差异表达的lncRNAs和mRNAs， 筛选标准 为倍数变化>1.5， P< 0.05； 步骤三： 对差异表达基因进行基因本体论(Geneontology， GO)分析， 描述差异表达基因 的功能属性， 通过KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)分析， 描述差异表达基因 的生物学途径， 筛选出5条上调lncRNA， 分别为： lncRNANR_003923、 NR_051983、 NR_103749、 NR_024358、 NR_046113， 4条下调 lncRNA， 分别为： ENST00000553396、 TCONS_00004501、 NR_ 028344、 NR_024049， 通过构建编码基因和非编码基因的共表达网络， 根据筛选出的差异表 达lncRNAs， 应用预测数据库miRcode匹配出与其相互作用的miRNA， 应用miRNA靶基因预测 数据库(miRDB、 miRTarBase和TargetScan)， 筛选 出相应的mRNA， 最终通过分子生物学方法， 确定lncRNANR_0 03923可以调节 筋膜组织瘢痕化； 步骤四： 样本收集情况(分组) 健康对照人群30例， 青光眼患者30例， 抗青光眼术后高眼压患者35例， 抗青光眼术后眼 压控制正常患者3 0例。 收集血 液样本2ml。 A.健康对照人群 a.年龄18 ‑75岁； b.无青光眼等眼科疾病 病史 c.无慢性疾病史、 短期或长期未服用激素治疗。 B.青光眼患者入组标准： a.年龄18 ‑75岁； b.眼内压(IOP)升高>21m mHg； c.角镜检查:前房角开 放， 或周边部虹膜与小梁面夹角减小， 房角变窄或关闭； d.激发试验—暗室及暗室俯卧试验可以呈 阳性； e.眼底及视野典型青光眼性改变； d.特征性视盘形态改变和视野缺损 杯、 盘比增大； 视乳头神经盘沿变窄； 盘沿凹陷或切迹； 越过视盘边缘的神经纤维层出权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115386627 A 2血(即Drance 出血或线状出 血)； 视杯纵向延伸扩大； 视网膜血 管离开视 乳头时屈膝成角等。 C.抗青光眼术后高眼压患者入组标准： a.已行青光眼手术患者 b.年龄18 ‑75岁； c.眼内压(IOP)升高>21m mHg； d.裂隙灯检查： 滤 过道明显瘢痕化 D.抗青光眼术后眼压控制正常患者入组标准： a.已行青光眼手术患者 b.年龄18 ‑75岁； c.眼内压(IOP)<16m mHg； d.裂隙灯检查： 滤 过泡功能正常， 形态隆起。 步骤五： 使用takara公司血清cfRAN提取试剂盒提取cfRNA； 使用Prome ga公司RT ‑PCR试 剂盒,产品货号为M5108,根据说明书进行， 取2ul上述RNA提取液， 70℃反应10min， 在反应管 加入以下组分： 10X逆转录酶 缓冲液， 10mmol/LdNTP， RNA酶抑制剂， Oligo(dT)， AMV逆转录酶， 无RNase去离 子水， Total体积20ul， votex混匀， 瞬时离心， PCR仪42℃反应15min， 进行cDNA第一链合成， 反 应结束， 95℃反应5mi n以灭活逆转录酶； 步骤五： 配置以下反应 体系： 10X荧光定量PCR缓冲液 低ROX溶液， 上游引物， 下游引物， dNTP， TaqDNA聚合酶， cDNA， 去离子水补充至总体积20ul， PCR条件为在95℃预变性3分钟， 然后95℃ 变性30秒、 52℃退火40秒， 共38个循环(PCR条 件可根据使用的荧 光定量PCR仪略做调整)， 在每 个循环结束时进行荧 光检测。 步骤六： 数据分析和结果判读 通过内参基因18 S对lncRNA数据进行 标准化， 并使用2‑Δ ΔCt方法进行 数据分析。 2.根据权利要求1所述的一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方 法， 其特征在于： 所述PCR条件为： 95℃预变性3分钟， 然后95℃变性30秒、 52℃退火40秒， 共 38个循环(P CR条件可根据使用的荧光定量PCR仪略做调整)， 在每个循环结束时进 行荧光检 测。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115386627 A 3