(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210659888.4 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 程蛟文　胡开林　刘佳　崔竣杰　 (74)专利代理 机构 广州智斧知识产权代理事务 所(普通合伙) 44649 专利代理师 朱双 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的 InDel标记及其检测引物与应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于鉴定苦瓜果实表面 粒瘤有无的InDel标记及其检测引物与应用。 本 发明的InDel标记为在如SEQ  ID NO.1所示 的核 苷酸序列的第82bp与第83bp之间位置存在一个 碱基T的缺失； 检测引物的上游引物核苷酸序列 如SEQ ID NO.3所示、 下游引物核苷酸序列如SEQ   ID NO.4所示。 本发明开发获得了与苦瓜粒瘤有 无完全共分离的InDel分子标记， 可以实现在苦 瓜种子或者幼苗阶段根据分子标记基因分型的 结果来判定苦瓜的粒瘤有无， 可以辅助苦瓜瘤型 的选择， 提高苦 瓜理想瘤型品种的培 育效率。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114875168 A 2022.08.09 CN 114875168 A 1.一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记， 其特征在于， 所述的InDel标记 为在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第82bp与第83bp之间位置存在一个碱基T的缺失。 2.根据权利要求1所述的InDel标记， 其特征在于， 所述的InDel标记的检测引物的上游 引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示、 下游引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 3.一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的检测引物， 其特征在于， 所述的检测引物的 上游引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示、 下游引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 4.一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的试剂 盒， 其特征在于， 含有权利要求3所述的 检测引物。 5.权利要求1所述的I nDel标记在鉴定 苦瓜果实表面粒瘤有无中的应用。 6.权利要求3所述的检测引物在鉴定 苦瓜果实表面粒瘤有无中的应用。 7.一种鉴定 苦瓜果实表面粒瘤有无的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： a.提取待鉴定 苦瓜DNA； b.采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物、 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的 下游引物， 以待鉴定 苦瓜DNA为模板进行PCR扩增； c.用内切酶Dde  I对PCR扩增产物进行酶切， 酶切产物进行电泳检测； d.结果判定： 当酶切产物只有1 17bp特征条带时， 判定该苦瓜为有粒瘤苦瓜 类型； 当酶切产物只有82bp和34bp特 征条带时， 判定该苦瓜为无 粒瘤苦瓜 类型； 当酶切产物同时含有1 17bp、 82bp和34bp特 征条带时， 判定该苦瓜为有粒瘤苦瓜 类型。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增反应体系为： 50n g/ μL的DNA 模板1 μL， Taq  Master Mix 5 μL， ddH2O 3 μL， 10 μM的上游引物0.5 μL， 10 μM的下游引物0.5 μL。 9.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增反应程序 为95℃3min； 95℃ 30s， 54℃3 0s， 72℃1mi n， 共计34个 循环； 72℃5mi n。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的Dde  I酶切反应体系为： 2μLPCR扩 增产物， 1μL  10×CutSmart  buffer， 5UDde  I， 6.5μL ddH2O； 反应程序为37℃1h， 65℃ 20min， 4℃保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875168 A 2一种用于鉴定苦 瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测 引物与应用 技术领域 [0001]本发明属于蔬菜分子育种技术领域， 具体涉及一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有 无的InDel标记及其检测引物与应用。 背景技术 [0002]苦瓜(Momordica  charantia  L.)属于葫芦科苦瓜属一年生攀援性草本植物， 原产 于非洲地区， 现广泛分布于亚洲和非洲的热带、 亚热带地区。 果瘤即果 实表面的瘤状凸起是 苦瓜最主要的特征性状。 依据果瘤的形态特征， 苦瓜大体上可分为果瘤数量多且小的粒瘤 苦瓜和无粒瘤的油苦瓜两种类型。 我国不同地域消费者对不同果瘤类型苦瓜的消费偏好不 同。 因此， 果瘤是影响市场消费选择的重要外观品质性状， 也是育种家进 行苦瓜新品种遗传 改良的重要目标性状之一。 [0003]当前， 育种家进行苦瓜果瘤性状选择时， 主要依靠传统的田间观察鉴定方法， 存在 鉴定效率低， 周期长等问题， 大大限制 了期望瘤型苦瓜新品种的选育效率。 因此， 开发苦瓜 果瘤性状共分离的分子标记， 以便利用分子标记对果瘤类型进行辅助选择育种， 可以实现 在种子或者苗期阶段对个体的果瘤类型进 行早期快速鉴别， 对于提高苦瓜新品种遗传改良 效率和水平具有重要意 义。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测 引物与应用， 可用 用于苦瓜果瘤性状分子标记辅助育种。 [0005]本发明选取有粒瘤 苦瓜材料‘K44’和无粒瘤油苦瓜材料 ‘K8‑201’分别作为母本和 父本， 通过人工杂交和自交获得果瘤性状分离的F2群体， 从F2群体中选择有粒瘤和无粒瘤的 各50个单株分别构建有粒瘤基因池和无粒瘤基因池， 连同父母本一起进行全基因组重测 序， 通过对两个基因池的SNP ‑index差值(ΔSNP ‑index)进行统计分析， 鉴定与苦瓜果瘤性 状显著关联的候选区域； 然后在候选区域进一步开发父母本之间存在多态的InDel (insertion  and deletion)分子标记， 最后利用多态性InDel分子标记对果瘤性状存在分 离的F2群体和自交系群体进行基 因分型， 旨在获得与果瘤 性状共分离的InD el分子标记， 最 终实现在种子或者苗期阶段对苦瓜果瘤性状进行早期快速鉴别， 提高苦瓜果瘤选择育种效 率。 具体如下： [0006]一、 鉴定与苦瓜粒瘤有无显著相关的候选基因 组区域 [0007]选取有粒瘤 苦瓜材料‘K44’和无粒瘤油苦瓜材料 ‘8‑201’分别作为母本和父本， 通 过人工杂交和自交获得果瘤性状分离的包含230个单株的F2群体； 对230个F2单株进行果瘤 类型鉴定， 从F2群体中选择有粒瘤和无粒瘤的各50个单株分别构建有粒瘤和无粒瘤基因 池； 连同父母本一起进行高深度(平均深度40.76 ×)全基因组重测序； 通过对两个基因池的 SNP‑index差值(ΔSNP ‑index)进行统计分析， 结果在苦瓜4号染色体上鉴定到1个与苦瓜果说　明　书 1/6 页 3 CN 114875168 A 3