(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210708462.3 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 中国农业科 学院兰州兽医研究所 地址 730046 甘肃省兰州市城关区徐家坪1 号 (72)发明人 田占成　任巧云　高闪电　独军政　 关贵全　刘光远　 (74)专利代理 机构 北京力量专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 11504 专利代理师 戴治娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序 列、 引物对、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 具体涉及一种用 于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、 引物对、 试剂盒及其应用。 本发明首先提供了一种用于鉴 定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列， 并提供了扩增 所述靶序列的特异性引物对， 所述的特异性引物 对弥补了现有检测技术的不足， 操作简便快捷， 灵敏度高、 特异性强、 简单快速、 成本低， 提高了 青海血蜱鉴定的效率和准确性， 能够满足青海血 蜱快速、 准确的物种分子鉴定需求。 适用于青海 血蜱分布调查， 种群分析及相关蜱传疫病的控制 等研究分析工作， 具有重要的理论意义和应用价 值。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 115058520 A 2022.09.16 CN 115058520 A 1.一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱(Haemaphysalis  qinghaiensis)的靶序列， 其特 征在于， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示。 2.如权利要求1所述的靶序列在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应 用。 3.用于扩增权利要求1所述靶序列的特异性引物对， 其特征在于， 正向引物的核苷酸序 列如SEQ ID No.2所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示。 4.如权利要求3所述的特异性引物对在非疾病 诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中 的应用。 5.如权利要求3所述的特异性引物对在制备鉴定或辅助鉴定青海血蜱试剂盒中的应 用。 6.一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中含有权 利要求3所述特异性引物对。 7.权利要求6所述的试剂盒在非疾病诊断目的 的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应用。 8.一种非疾病 诊断目的的鉴定或辅助鉴定待测硬蜱类寄生虫是否为青海血蜱的方法， 包括如下步骤： (1)提取待测昆虫的基因 组DNA； (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 采用权利 要求3所述引物对进行PCR扩增， 然后 进行如下判断： 如果采用所述引物对可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增， 待测硬蜱类寄 生虫为或候选为青海血蜱； 如果采用所述引物对不可以实现以所述基因组DNA为模板的特 异性扩增， 待测硬蜱类寄生虫不 为或候选不 为青海血蜱。 9.如权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 步骤(2)所述的PCR扩增： 反应体系为50μl， 加入10 ×PCR buffer 5μl、 上、 下游引物对(10mM)各2μl、 dNTPs (10mM)2 μl、 Taq酶(50U)1μl以及10～20ng  DNA模板2 μl， 加灭菌双蒸水至50 μl， 以灭菌双蒸 水为阴性对照。 10.如权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 步骤(2)所述的PCR扩增： 反应程序为： 预热94℃， 5min； 94℃ 30s， 63℃ 30s， 72℃ 30s， 共30个循环； 末次延伸72℃， 7min， 4℃保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058520 A 2一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的 靶序列、 引物对、 试剂盒 及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序 列、 引物对、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]青海血蜱属于寄螨目， 蜱总科， 硬蜱科， 主要分布在我国的青海省和甘肃省的牧 区， 属于我国的特有种， 是广泛寄生于脊椎动物的体外 寄生虫。 一种蜱可传播多种不同的病 原， 一种病原也可由多种不同的蜱传播。 青海血蜱可传播 羊泰勒虫， 羊巴贝斯虫和牦牛泰勒 虫等， 对牧区危害极大。 青海血蜱为三宿主蜱， 一个生活周期包括卵、 幼蜱、 若蜱和成蜱4个 阶段， 更换3次宿主。 蜱虫的分类鉴定对于蜱传播病原的溯源和流行病学调查非常重要。 [0003]蜱的鉴定包括形态学鉴定和分子生物学鉴定， 传统的形态学鉴定， 其优点是比较 直观、 操作简 便、 对环境条件要求低等， 但 这种方法对鉴定人员的专 业知识、 工作经验、 特殊 的仪器设备和标本的完整性等方面要求高。 另外， 形态学方法对一些外形比较相似的蜱、 肢 体不完整的蜱、 亲缘种蜱以及处于卵 发育阶段等的一些特殊蜱样品较难以鉴定。 近几年发 展起来的分子检测技术， 特别 是PCR技术， 在微生物快速鉴定和 检测方面的应用， 为寄生虫 的快速检测开辟了新的途径， 对于克服蜱虫传统形态学鉴定的弊端有显著优势。 在传统形 态学分类的基础上， 结合分子生物学鉴定方法， 能简易、 准确鉴定蜱的种类。 [0004]本发明在研究过程中发现， 在Genbank数据库中登陆的青海血蜱一段基因组D NA序 列(包括ITS1， 5.8srRNA和ITS2基因)与Genbank数据库登陆号为(JQ737126.1)的镰形扇头 蜱的基因组DNA序列完全一致。 因镰形扇头蜱与青海血蜱在形态学和其他分子分类数据上 差异非常大。 因此， 申请人认 为登录号为(JQ737126.1)的基因组DNA序列实际上来源于青海 血蜱。 在传统形态学分类鉴定青海血蜱的基础上， 为了进一步采用分子分类的方法明确 鉴 定青海血蜱， 经过生物信息学序列分析， 申请人发现了青海血蜱的一对特异 性引物， 所述的 特异性引物对可以用于鉴定青海血蜱， 有利于防控青海血蜱及其传播病原的溯源和流行病 学调查。 发明内容 [0005]针对上述技术问题， 本发明的首要目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱 (Haemaphysal is qinghaiensis)的靶序列， 所述靶序列的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示。 [0006]本发明的第二目的是提供所述的靶序列在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青 海血蜱中的应用。 [0007]本发明的第三目的是提供用于扩增所述靶序列的特异性引物对， 正向引物的核苷 酸序列如SEQ  ID No.2所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示。 [0008]本发明的第四目的是提供所述的特异性引物对在非疾病诊断目的的鉴定或辅助 鉴定青海血蜱中的应用。说　明　书 1/4 页 3 CN 115058520 A 3