(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210755835.2 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 南开大学 地址 300457 天津市滨 海新区宏达街23号 南开大学泰达生物技 术研究院 (72)发明人 郭玺　刘斌　武潘　王婧　 (74)专利代理 机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 专利代理师 朱红星 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种用于迟缓爱德华菌的环介导等温扩增 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及一种对4种血清型迟缓爱德华菌 的环介导等温扩增 （LA MP） 检测方法及应用。 本发 明以迟缓爱德华菌G6053， G6057， G6058， G6059的 O抗原基因簇内的特异基因， 即 wzx基因为靶基 因， 设计并筛选了对上述4种血清型迟缓爱德华 菌的各自四条引物， 并建立了一种环介导等温扩 增 （LAMP） 反应体系， 为迟缓爱德华菌的检测和血 清学分型提供了相应技术。 利用本发明的LA MP体 系检测迟缓爱德华菌， 并且对其进行血清学分 型， 具有操作简便和快速高效的优点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图2页 CN 114854887 A 2022.08.05 CN 114854887 A 1.一种对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的LAMP引物， 其特征是在迟缓爱德华菌 G6053， G6057， G6058， G6059的 wzx基因中分别 选取的4个DNA片段， 其核苷酸序列依次如SEQ   ID NO:1‑SEQ ID NO:16所示。 2.一种环介导等温扩增 （LAMP） 反应体系， 其含有权利要求1所述对迟缓爱德华菌进行 检测与分型的引物的， 组成 成分如下： 。 3.一种权利要求2所述的环介导等温扩增 （LAMP） 反应体系的在用于检测迟缓爱德华菌 菌株4个血清型 方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854887 A 2一种用于迟缓爱德华菌的环 介导等温扩增检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于细菌检测方法技术领域， 涉及用于迟缓爱德华菌4种血清型的环介导 等温扩增检测方法及应用。 背景技术 [0002]迟缓爱德华菌可在大多数水环境中生存， 是一种人畜共患病菌， 可对多种经济型 鱼类造成感染， 造成严重的经济损失。 同时， 该菌也可以感染哺乳动物及人类， 其中最常见 的感染疾病是胃肠炎， 若不慎引发肠外或全身感染， 还可导 致较高的死 亡率。 [0003]环介导等 温扩增 （Loop ‑mediated  Isothermal  Amplification， LAMP） 技术可在等 温 （60‑65℃） 条件下， 短时间 （通常是一小时内） 内进 行核酸扩增， 通过反应前后的反应液颜 色变化或简单的DNA琼脂糖凝胶电泳来观察实验结果。 与常规PCR相比， 不需要模板的热变 性、 温度循环 等过程， 且在灵敏度、 特异 性和检测范围等指标上甚至优于P CR技术， 检测成本 则低于荧 光定量PCR。 [0004]其技术原理为： 60 ‑65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在 65℃左右处于动 态平衡状态。 因此， DNA在此温度下合 成是可能的。 利用4种特异引物和依靠一种高活性链置 换DNA聚合酶， 使得链置换DNA合成在不停地自我循环。 [0005]扩增分两个阶段： 第1阶段为起始阶段， 任何一个引物向双链DNA的互补部位进行 碱基配对延伸时， 另一条链 就会解离， 变成单链。 上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c 结合， 在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。 外部引物F3与模板F3c结 合并延伸， 置换出完整的FIP连接的互补单链。 FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。 自 我碱基配对形成环状结构。 以此链为模板， 下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合 成， 形成哑铃状结构的单链。 迅速以3 ’末端的F1区段为起点。 以自身为模板， 进 行DNA合成延 伸形成茎环状结构。 该 结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 [0006]第2阶段是扩增循环阶段。 以茎环状结构为模板， FIP与茎环的F2c区结合。 开始链 置换合成， 解离出的单链核酸上也会 形成环状结构 。 迅速以3 ’末端的B1区段为起点， 以自身 为模板， 形成DNA合 成延伸及链置换， 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA， BIP引物上的 B2与其杂交， 启动新一轮的扩增， 且产物DNA长度增加一倍。 在反应体系中添加2条环状引物 LF和LB， 它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合 成。 周而复始， 扩增的最后产 物是具有 不同个数茎环结构、 不同长度DNA的混合物， 且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 发明内容 [0007]为实现上述目的， 本发明公开了一种对迟缓爱德华菌4个血清型血清型菌株进行 检测与分型的LAMP引物， 该引物含有FIP  引物、 F3引物、 BIP引物以及 B3引物。 [0008]LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域， 基于靶基因  3'端的F3c、 F2c和Flc区以及  5'端的Bl、 B2和B3区等6个不同的位 点设计4种引物。 [0009]Primer) Inner FIP(Forward： 上游内部引物， 由F2区和F1C区域组成， F2区与靶基说　明　书 1/5 页 3 CN 114854887 A 3