(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210700008.3 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 云南省畜牧兽医科 学院 地址 650224 云南省昆明市金 殿青龙山 (72)发明人 宋建领　薛晓岩　张振兴　 (74)专利代理 机构 北京专赢专利代理有限公司 11797 专利代理师 刘燕飞 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于 血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物 组及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种用于血清4型禽腺病毒LAMP 检测的引物组及其应用， 包括试剂盒及其检测方 法， 所述引物组包括以下4条引物： 如SEQ  ID NO: 1‑4所示， 本发明同时提供一种用于 血清4型禽腺 病毒LAMP检测的试剂盒和检测方法。 采用本发明 的引物组和检测方法， 仅有FAdV ‑4核酸检测呈阳 性， 其他禽类常见病核酸检测均呈阴性， 表明本 发明的引物组及检测方法对其他10种病原无交 叉反应， 仅针对FAdV ‑4具有特异性。 本发明采用 的PicoGreen染料在反应前添加到PCR管的管盖 上， 反应结束后通过摇晃PCR管让PicoGreen染料 与反应液混合， 然后直接观察显色反应就可以获 得检测结果， 可以避免二次开管滴加染料形成气 溶胶污染造成假阳性的风险， 提高FAdV ‑4型检测 的准确性和可靠性， 更有利于病毒检测和基层推 广应用。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图4页 CN 114990262 A 2022.09.02 CN 114990262 A 1.一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括以下4 条引物： 如SEQ  ID NO:1‑4所示： FAdV‑4‑F3： 5’ ‑ACGAGTACATGA ACAAGCGC‑3’； FAdV‑4‑B3： 5’ ‑GGCACTTGGATGTGGAAGTT‑3’； FAdV‑4‑FIP： 5’ ‑TGTCCATCTGGTCGATGGACCA‑CACCAACGTYGTCGACATG ‑3’； FAdV‑4‑BIP： 5’ ‑CAACCCCTTCAACCACCACAGA‑ACGTAGCGRCTGT TTCCCA‑3’。 2.根据权利要求1所述用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组， 其特征在于， 所述引 物组是以禽腺病毒特异性Hexon基因的高保守区域序列为目的基因设计获得， 所述高保守 区域序列如SEQ  ID NO:5所示。 3.一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括所述 引物组、 dNTP混合物、 MgSO4、 10 ×Isothermal恒温反应的缓冲液、 链置换DNA聚合酶、 可视化 染料、 阳性对照和阴性对照。 4.根据权利要求3所述用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的试剂盒， 其特征在于， 所述可 视化染料为PicoGre en染料。 5.一种血清4型禽腺病毒的LAMP检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一： 先建立 LAMP反应 体系： 在PCR管中加入以下组分 步骤二： 反应前将4 μL  PicoGreen荧光染料加入到PCR管内盖上； 步骤三： 6 3℃孵育65min， 反应结束后80℃反应4mi n终止LMAP反应； 步骤四： 摇晃PCR管使管内盖上的PicoGreen荧光染料与管内反应液混合， 即可直接观 察， 反应液为亮黄绿色的检测结果 为阳性， 反应液为橘色的检测结果 为阴性。 6.权利要求1所述引物组在检测样品中是否含有血清4型禽腺病毒的产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990262 A 2一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物 组及其应用， 包括试剂盒及其检测方法。 技术背景 [0002]禽腺病毒是腺病毒科腺病毒属的成员， 根据限制性内切酶试验， 禽腺病毒分为五 个亚种(A ‑E)， 根据血清交叉中和试验， 它 被分为12个血清型(1 ‑8a， 8b‑11)。 禽腺病毒是危 害养禽类的病原之一， 在养殖场中主要造成： 禽肌胃糜烂、 包涵体肝炎、 心包积液综合症 等。 该病主要发生于20 ‑30日龄的肉鸡， 包括817、 肉杂等， 发病后4 ‑8天为死亡高峰， 病程8 ‑15 天， 死亡率达20～30％。 同时蛋鸡20 ‑70日龄以及200 ‑300 日龄也有发生， 但死亡率低于肉 鸡。 目前， 该病的发病区域不断扩大， 给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。 现已证实， 该病 的病原为禽腺病 毒4型(fowl adenovirus  4,FAdV‑4)。 因此， 急待开发精确、 灵敏、 快速、 无 污染的临床病原微 生物检验方法。 [0003]LAMP检测方法灵敏度高， 比传统的PCR方法高2～5个数量级； 反应时间短； 临床使 用不需要特殊的仪器； 操作简单， 不论模板是DNA还是RNA， 均可 肉眼观察结果， 因此适宜用 于快速检测血清4型禽腺病毒。 目前国内已有数种针对FAdV ‑4 LAMP检测的技术， 但现有技 术存在选择靶基因保守性低、 可视化方法操作较繁琐且误差大、 操作结果易出现假阳性等 问题， 可靠性较低。 发明内容 [0004]本发明提供了一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组、 试剂盒及其检测方 法和应用， 用于解决以上问题。 [0005]本发明提供了一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组， 所述引物组包括以 下4条引物： 如SEQ  ID NO:1‑4所示： [0006]FAdV‑4‑F3： 5’ ‑acgagtacatgaacaagcgc‑3’； [0007]FAdV‑4‑B3： 5’ ‑ggcacttggatgtggaagtt‑3’； [0008]FAdV‑4‑FIP： 5’ ‑tgtccatctggtcgatggacca‑caccaacgtygtcg acatg‑3’； [0009]FAdV‑4‑BIP： 5’ ‑caaccccttcaaccaccacaga‑acgtagcgrctgt ttccca‑3’。 [0010]进一步， 所述引物组是以禽腺病毒特异性Hexon基因的高保守区域序列为目的基 因设计获得， 所述高保守区域序列如SEQ  ID NO:5所示。 [0011]本发明同时提供一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的试剂盒， 所述试剂盒中包 括所述引物组、 dNTP混合物、 MgSO4、 10 ×Isothermal恒温反应的缓冲液、 链置换DNA聚合酶、 可视化染料、 阳性对照和阴性对照。 [0012]优选地， 所述可视化染料为PicoGre en染料。 [0013]本发明提供了一种血清4型禽腺病毒的LAMP检测方法， 包括如下步骤： [0014]步骤一： 先建立 LAMP反应 体系(25 μL)： 在PCR管中加入以下组分：说　明　书 1/9 页 3 CN 114990262 A 3