(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210670419.2 (22)申请日 2022.06.14 (71)申请人 武汉市景肽生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新大道888号高农生物园总部B 区20#楼3层316号房 (72)发明人 谭超　杨燕宇　赵建华　罗辉　 (74)专利代理 机构 武汉天领众智专利代理事务 所(普通合伙) 42300 专利代理师 刘诚 (51)Int.Cl. C12Q 1/6811(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于等位基因多态性分型的引物设计 方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于等位基因多态性分 型的引物设计方法及其应用， 属于分子生物学技 术领域， 所述引物设计方法包 括如下步骤： S1、 根 据待检测目的基因序列， 设计特异性引物序列和 荧光探针序列； S2、 将一段和所述荧光探针序列 完全或部分相同、 并且和待检测目的基因序列不 匹配的tag序列添加到所述特异性引物序列的内 部， 即可得到用于等位基因多态性分型的引物。 本发明将一段和荧光探针序列完全或部分相同、 并且和待检测目的基因序列不匹配的tag序列设 计在用于等位基因多态性分型的引物(ASP)内 部， 所述引物 不仅能高效完成待检测目的基因的 分型鉴定， 还够有效改善AS ‑PCR反应中所述引物 和非匹配 基因型模板之间发生的错配情况。 权利要求书2页 说明书13页 序列表5页 附图6页 CN 114958972 A 2022.08.30 CN 114958972 A 1.一种用于等 位基因多态性分型的引物设计方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 根据待检测目的基因序列， 设计特异性引物序列和荧 光探针序列； S2、 将一段和所述荧光探针序列完全或部分相同、 并且和待检测目的基因序列不匹配 的tag序列添加到所述特异性引物序列的内部， 即可 得到用于等 位基因多态性分型的引物。 2.根据权利要求1所述的用于等位基因多态性分型的引物设计方法， 其特征在于， 所述 tag序列在所述引物上的插入位点距离引物3＇ 末端不少于10个碱基， 距离引物5＇ 末端不少 于1个碱基。 3.根据权利要求1所述的用于等位基因多态性分型的引物设计方法， 其特征在于， 所述 tag序列的长度为15～5 0个碱基。 4.根据权利要求1所述的用于等位基因多态性分型的引物设计方法， 其特征在于， 所述 荧光探针为 I型荧光探针， 所述 I型荧光探针的两端分别标记荧 光基团和猝灭基团。 5.根据权利要求1所述的用于等位基因多态性分型的引物设计方法， 其特征在于， 所述 荧光探针为II型荧光探针， 所述II型荧光探针的5＇ 端为茎环结构， 荧光基团和猝灭基团分 别标记在茎端。 6.根据权利要求4所述的用于等位基因多态性分型的引物设计方法， 其特征在于， 所述 tag序列和所述 I型荧光探针的序列一 致性不少于50％。 7.根据权利要求5所述的用于等位基因多态性分型的引物设计方法， 其特征在于， 所述 tag序列和所述 II型荧光探针的3＇ 端的序列一 致性不少于50％。 8.一种用于等位基因多态性分型的引物， 其特征在于， 采用权利要求1～7任一项所述 的用于等 位基因多态性分型的引物设计方法设计得到 。 9.一种用于等 位基因多态性分型的引物设计系统， 其特 征在于， 包括如下模块： 信息获取模块： 用于获取待检测目的基因序列， 然后根据待检测目的基因序列设计特 异性引物序列和荧 光探针序列； 引物设计模块： 用于将一段和所述荧光探针序列完全或部分相同、 并且和待检测目的 基因序列不匹配的tag序列添加到所述特异性引物序列的内部， 即可得到用于等位基因多 态性分型的引物。 10.根据权利要求9所述的用于等位基因多态性分型的引物设计系统， 其特征在于， 所 述引物设计模块还包括引物相关参数优化模块， 所述引物相关参数优化模块用于对引物在 模板上的位置、 引物长度、 退火温度、 GC含量、 tag序列选择、 tag序列在引物上的插入位点进 行优化。 11.一种用于等位基因多态性分型的检测体系， 其特征在于， 包括权利要求8所述的用 于等位基因多态性分型的引物， 所述引物应用于一个或多个AS ‑PCR产物的检测， 所述检测 体系还包括一条能够和所述引物配对的通用反向引物、 荧光探针、 缓冲体系、 DNA聚合酶、 dNTPs和待检测目的基因。 12.根据权利要求11所述的用于等位基因多态性分型的检测体系， 其特征在于， 所述 tag序列在不同的所述引物内的插 入位点和3＇ 末端碱基的距离可以相同或不同。 13.根据权利要求11所述的用于等位基因多态性分型的检测体系， 其特征在于， 不同的 所述引物内的ta g序列的长度可以相同或不同。 14.根据权利要求11所述的用于等位基因多态性分型的检测体系， 其特征在于， 所述引权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958972 A 2物位于多态性 位点上游或多态性 位点下游。 15.一种用于等位基因多态性分型的检测试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求11～14任 一项所述的用于等 位基因多态性分型的检测体系。 16.一种用于等 位基因多态性分型的检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 设计权利要求8所述的用于等 位基因多态性分型的引物； S2、 按照权利要求11～14任一项所述的用于等位基因多态性分型的检测体系， 添加所 需要的试剂后， 并进行AS ‑PCR反应； S3、 反应结束后， 通过分析荧 光信号强度即可完成待检测目的基因的分型鉴定 。 17.权利要求8所述的用于等位基因多态性分型的引物或权利要求11～14任一项所述 的用于等 位基因多态性分型的检测体系在等 位基因多态性分型检测中的应用。 18.根据权利要求17所述的应用， 其特征在于， 所述等位基因多态性分型检测为水稻等 位基因多态性分型检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958972 A 3