(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221071645 0.5 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 广州锦派生物科技有限责任公司 地址 510000 广东省广州市增城区宁西街 创立路3号3幢4层40 3室 (72)发明人 吴孝林　 (74)专利代理 机构 广州市科丰知识产权代理事 务所(普通 合伙) 44467 专利代理师 王海曼 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测 的基因靶标及其试剂盒与应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于甲状腺结节相关基 因甲基化检测的基因靶 标及其试剂盒与应用； 旨 在提供一种针用于甲状腺结节相关基因甲基化 检测的引物和探针， 该基因靶 标具有较高的敏 感 性和特异性从而为临床提供指导， 辅助诊断甲状 腺结节的良恶性； 含有该基因的引物和探针的试 剂盒， 检测时不需要进行测序， 而是使用PCR进行 检测， 方法较简单； 具有较高的敏 感性和特异性， 检测特异性为93.1％； 其物探针组合为SLCO2A1 基因甲基化标志物、 EPB41L3基因甲基化标志物 的其中之一或者组合； 本发明属于生物技术领 域。 权利要求书1页 说明书16页 序列表2页 附图2页 CN 115029433 A 2022.09.09 CN 115029433 A 1.一种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测的基因靶标， 其特征在于， 所述的基因靶 标为SLCO2 A1基因甲基化标志 物和EPB41L3基因甲基化标志 物的其中之一或者组合； 所述的SLCO2A1基因甲基化标志物上游引物核酸序列如SEQ  ID NO.1所示的序列， 下游 引物核酸序列如SEQ  ID NO.2所示的序列， 检测探针序列核酸序列如SEQ  ID NO.3所示的序 列； 所述的EPB41L3基因甲基化标志物上游引物核酸序列如SEQ  ID NO.4所示的序列， 下游 引物核酸序列如SEQ  ID NO.5所示的序列， 检测探针序列核酸序列如SEQ  ID NO.6所示的序 列。 2.一种用于甲状腺结节相关基因 甲基化检测试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述 的引物和探针。 3.根据权利要求1所述的一种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂盒， 其特征在 于， 所述检测试剂盒还 包括DNA提取 试剂盒、 PCR反应液1和PCR反应液2。 4.根据权利要求3所述的种用于甲状腺结节相关基因 甲基化检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒采用石蜡DNA提取 试剂盒。 5.据权利要求3所述的种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂 盒， 其特征在于， 所 述的PCR反应液1包括DNA聚合酶和含mg2+的5Xbuffer。 6.据权利要求3所述的种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂 盒， 其特征在于， 所 述的PCR反应液2包括dNTP  mix， 内参基因和目标基因引物和探针。 7.权利要求2所述的用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂盒的使用方法， 其特征 在于， 包括如下步骤： 1)提取待测甲状腺结节样本的DNA； 2)使用如权利要求2所述的用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂盒对提取的DNA 样本进行PCR扩增； 3)对PCR扩增的产物进行测序分析。 8.根据权利要求1所述的用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂盒的使用方法， 其 特征在于所述的PCR扩增方法为： 吸取5μl权利要求7步骤1)所得到的DNA， 加入10μl  PCR反应液1和PCR反应液2进行PCR 扩增； PCR扩增程序为9 5℃， 5min； 9 5℃25sec， 55℃30sec， 72℃2 0sec收集荧光， 45循环； 40℃ 30sec。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029433 A 2一种用于甲状腺结节相关基因甲 基化检测的基因靶标及其试 剂盒与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种用于甲状腺结节相关基 因甲基化检测基 因靶标及其试剂盒与应用。 背景技术 [0002]甲状腺结节是指由放射线照射等各种原因导致甲状腺内出现一个或多个组织结 构异常的团块。 甲状腺结节临床极为常见， 常见于女性。 甲状腺结节多为良性， 恶性结节仅 占甲状腺结节的0.1％左右。 甲状腺结节包括良性结节、 毒性结节性甲状腺肿， 单纯性结节 性甲状腺肿。 怪性淋巴性甲状腺炎， 亚急性甲状腺炎等病。 甲状腺结节以良性肿痛多见。 [0003]根据 《2021版中国临床肿瘤学会(CSCO)分化型甲状腺癌诊疗指南》 指出临床细针 穿刺(FNA)和病理检查的甲状腺结节样本存在一定比例的无法确诊的现象。 指南中建议细 针穿刺后的样本可以进行分子检测的方法进行良恶性 鉴别。 [0004]目前临床的分子检测靶标包括BRAF突变、 RAS突变、 RET/PCT重排等。 这类型的分子 靶标由于变异类型较多， 需要测序这类复杂的检测技术才能尽量多的检测出来从而实现甲 状腺结节的鉴别。 另外， 即使患者甲状腺结节样本出现上述分子靶标的变异， 临床上也 发现 这类甲状腺结节也有很多并非恶性， 临床上病理诊断依赖于人的观察和主观判断， 存在技 术水平和人的差异性从而影响临床检测的准确性。 [0005]例如文献 《Clinical  Validation  of the ThyroSeq v3 Genomic Classifier  in  Thyroid Nodules With Indeterminate  FNA Cytology》 中两个使用测序方法鉴定甲状腺 结节产品的特异性分别为81.6％和68.3％。 发明内容 [0006]针对以上现有技术存在的缺点和不足， 本发明的第一个目的是用于甲状腺结节相 关基因甲基化检测的基因靶标， 通过检测甲状腺结节样本的DNA中的甲基化标志物， 提供一 种新的分子诊断技 术路径。 [0007]本发明的第二个目的是提供一种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂盒， 该 试剂盒检测时不需要进行测序， 而是使用PCR进行检测， 方法较简单； 具有较高的敏感性和 特异性， 检测特异性 为93.1％。 [0008]本发明的第三个目的是提供的一种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测试剂盒 的使用方法。 [0009]为此， 本发明提供的第一个技 术方案是这样的： [0010]一种用于甲状腺结节相关基因甲基化检测的基因靶标， 所述的基因靶标为 SLCO2A1基因甲基化标志 物和EPB41L3基因甲基化标志 物的其中之一或者组合； [0011]所述的SLCO2A1基因甲基化标志物 上游引物核酸序列如SEQ  ID NO.1所示的序列， 下游引物核酸序列如SEQ  ID NO.2所示的序列， 检测探针序列核酸序列如SEQ  ID NO.3所示说　明　书 1/16 页 3 CN 115029433 A 3