(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210590161.5 (22)申请日 2022.05.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114921567 A (43)申请公布日 2022.08.19 (73)专利权人 江西省农业科 学院农业应用微 生 物研究所 （江西省农村能源研究 中心） 地址 330200 江西省南昌市南 莲路602号 (72)发明人 吴彩云　范琳娟　徐雪亮　刘子荣　 姚健　康美花　姚英娟　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 有限公司 1 1562 专利代理师 李彬 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 110951838 A,2020.04.0 3 CN 111206106 A,2020.0 5.29 吴彩云.江西省山药病原线虫种类鉴定及地 理分布. 《植物保护》 .202 2,第48卷(第4期), 陈晓玲.咖啡短体线虫分子鉴定. 《植物检 疫》 .2009,第23卷(第2期), Ke Wang.Oc currence of Pratylenc hus coffeae Causi ng Root Rot of Soybean i n Shandong Provi nce of C hina. 《Plant Dis.》 .2021,第10 5卷(第4期), Yu Li.Occurrence of Ro ot-Lesion Nematode Pratylenc hus coffeae on Corn i n Xinjiang Uygur Auto nomous Regi on, China. 《Plant Dis》 .202 2, 审查员 陈丹 (54)发明名称 一种用于检测咖啡短体线虫的RPA引物和探 针、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测咖啡短体线虫 的RPA引物和探针、 试剂盒及检测方法， 属于线虫 检测技术领域。 所述RPA引物如SEQ  ID NO： 1‑2所 述， 探针如SEQ  ID NO： 3所示。 基于所述RPA引物 和探针建立的RPA检测方法， 可以特异性、 高灵敏 度的检测咖啡短体线虫。 且本发 明的检测方法可 以检测单个或者混合咖啡短体线虫DNA样品， 兼 具检测准确、 灵敏度高、 操作简单、 耗时短、 对仪 器设备要求较低等优点， 对咖啡短体线虫的早期 和田间诊断检测及科 学施药提供新方法。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 114921567 B 2022.12.20 CN 114921567 B 1.一种用于检测咖啡短体线虫的RPA引物和探针， 其特 征在于， 包括： 上游引物RPA ‑F2： 5’ ‑CCAAACACATATAGTGTGCATATGC CCAACATTGC‑3’； 下游引物RPA ‑R5： 5’ ‑CCACTCTGTGTGTGCTGAGCG GTTGAGCGG‑3’； RPA探针： 5 ’ ‑GAGCACTCTGCT TAGCAGGGAGTGCAAGTTGTTTGGTGCGCAGTACGC ‑3’  ； 所述下游引物RPA ‑R5的5’端用Biotin修饰； 所述RPA探针5 ’端用FAM标记， 3 ’端用C3‑Spacer修饰， 且在RPA探针的序列中间距5 ’的 33bp处进行THF修饰。 2.一种用于检测咖啡短体线虫的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的RPA引物 和探针。 3.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括： RPA反应管、 阳性对照 模板和阴性对照模板 。 4.一种利用权利要求1所述的RPA引物和探针检测咖啡短体线虫的方法， 其特征在于， 包括： 获取待测线虫样品的DNA， 利用如下任一种方法检测咖啡短体线虫： （1） 以所述的DNA为模板， 利用权利要求1中所述的上游引物RPA ‑F2和下游引物RPA ‑R5， 进行RPA扩增反应， 所得扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测， 若在211bp处出现扩增条带则为 咖啡短体线虫， 反 之则否； （2） 以所述的DNA为模板， 利用权利要求1中所述的上游引物RPA ‑F2、 下游引物RPA ‑R5以 及RPA探针， 进 行RPA扩增反应， 所得扩增产 物利用测流层析试纸条进行分析， 根据所述试纸 条上观察到的质控线与检测线情况判读结果。 5. 如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 第 （1） 种检测方法中， 所用的扩增体系为： 反 应缓冲液A  buffer 29.4 μL， 浓度均为10 μM的上游引物RPA ‑F2和下游引物RPA ‑R5各2 μL， 待测DNA模板1  μL， 280mM的MgAc溶 液2.5 μL， 冻干酶粉5.0mg， d dH2O 补充至50 μL； 扩增条件： 38℃反应25mi n， 随后冰上终止反应。 6.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 第 （2） 种检测方法中， 所用的扩增体系为： 反 应缓冲液A  buffer 29.4 μL， 浓度均为10 μM的上游引物RPA ‑F2和下游引物RPA ‑R5各2 μL， 浓度为10 μM的RPA 探针0.6 μL， 待测DNA模板1  μL， 280mM的MgA c溶液 2.5 μL， 冻干酶粉5.0mg， ddH2O 补充至50 μL； 扩增条件： 在37 ‑39℃反应8 ‑12min， 随后冰上终止反应。 7.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 第 （2） 种检测方法中， 所述判读结果的方法 为： 如果试纸条的质控线C和检测线T均出现红色条带， 则判定被检样品为阳性， 表明该样品 中含有咖啡短体线虫； 如果试纸条仅有质控线C出现红色条带， 则判定被检样品为阴性， 表 明该样品中不含有咖啡短体线虫； 如果质控线C和检测线T两条线均未显色， 则说明结果无 效。 8.如权利 要求1所述的RPA引物和探针、 权利 要求2或3所述的试剂盒、 或者权利 要求4‑7 任一项所述的方法在检测咖啡短体线虫中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921567 B 2一种用于 检测咖啡短体线虫的R PA引物和探针、 试剂盒及检测 方法 技术领域 [0001]本发明涉及线虫检测技术领域， 特别是涉及一种用于检测咖啡短体线虫的RPA引 物和探针、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]长期以来由于受到土地资源和种植习惯等因素的影响， 很多作物连年栽培， 导致 了严重的连作障碍问题， 其中线虫病的发生日益加重， 对农业生产影响极大。 针对不同作 物， 其病原线 虫种类有差异， 其中咖啡短体线虫是危害最为严重的短体线 虫之一。 咖啡短体 线虫(Pratylenchus  coffeae)是植物根系内迁移性寄生线虫， 可引起许多作物的根腐线虫 病， 给世界农业生产造成了 极大的危害， 其寄主非常广泛， 可以危害山药、 小麦、 玉米、 大豆、 芝麻、 烟草、 番茄等90多种植物。 因此， 急 需针对咖啡短体线 虫提出防治 策略。 线虫在自然界 中的种类繁多， 能够快速、 准确的鉴定咖啡短体线虫 是防治该线虫的基础。 [0003]鉴定咖啡短体线虫的传统方法是形态学方法， 由于线虫的有效鉴别特征不多， 且 许多表型特征不稳定， 使得此方法鉴定过程繁琐， 且鉴定结果常常会 带有主观 性， 所得结果 可靠性差。 随着分子生物学 的发展， 在分子水平上鉴定线虫因其准确 性强而获得广泛的应 用。 其中P CR扩增技术因具有灵敏度高、 特异 性强、 准确高效等优点而获得广泛应用， 但是该 技术对于仪器设备、 实验环境以及操作人员的要求较高， 另外还存在成本高， 耗时长等弊 端， 使其应用受到 很大限制。 [0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase  polymerase  amplification， 简称RPA)是一种 由重组酶、 单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶参与的恒温扩增新技术， 可在37℃～45℃ 下连续进行反应， 反应时间只需15～30min， 该技术相比于环介导等温扩增反应(LAMP)， 只 需要一对特异性引物， 反应所需温度更低， 反应时间更短， 且扩增后产生单一的目的条带， 特异性强， 灵敏度高， 非常适用于疾病诊断和现场检测。 目前， RPA技术已广泛应用于病毒、 细菌和动植物寄生线虫的快速检测， 但尚未 见其在短体线虫检测方面的报道。 [0005]基于侧流层析试纸条的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase  Polymerase   Amplification  Assay combined  with lateral flow dipstick， 简写为： LFD ‑RPA)， 其在 37‑42℃恒温下就可进行扩增反应， 对设备的要求低， 如用水浴锅即可， 甚至可以直接用人 的体温进行加热， 同时通过侧流层析试纸条来读取试验结果， 简单可靠， 一般人员皆可， 对 人员的素质要求低。 [0006]目前， 尚未发现应用试纸条RPA对咖啡短体线虫进行检测的报道。 发明内容 [0007]本发明的目的是提供一种用于检测咖啡短体线虫的RPA引物和探针、 试剂盒及检 测方法， 以解决上述现有技术存在的问题， 该RPA引物和探针能特异性、 高灵敏度