(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211155052.7 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 江苏海洋大学 地址 222005 江苏省连云港市海州区苍梧 路59号 申请人 青岛华晶生物技 术有限公司 (72)发明人 司鑫鑫　张晓　张全　王训琨　 田珍　汤新颖　高嵩　石晓　 (74)专利代理 机构 南京专信知识产权代理有限 公司 326 05 专利代理师 郝晓燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测人APOE基因分型的引物探针 组及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种可用于检测人APOE基因 分型的引物组及检测方法。 提供的引物组和探针 可对APOE基因388T>C、 526C>T 位点的多态性进行 检测， 确定APOE基因分型， 不涉及昂贵的NGS设 备， 整个过程可以在临床实验室中常见的仪器上 进行。 此外， 该方法还具有高灵敏度、 特异性强等 优点。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 115505634 A 2022.12.23 CN 115505634 A 1.一种用于检测APOE基因多态性的组合物， 包括针对用于检测待检样品中分别与AP OE  388位点和APOE 526位点相关的特异性引物对和探针， 包括： APOE 388位点基因分型检测引物组： APOE 388‑RPA‑正向引物： C CCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACG； APOE 388‑RPA‑反向引物： G GTGGGAGGCGAGGCGCACCCGCAG； APOE 388‑LDR‑T： CGGTTTTGGCGCAGTGACG GCCGCGGTACTGCAC CAGG CGGCCGCA； APOE 388‑LDR‑C： CGGTTTTGGCGCAGTGACG GCCGCGGTACTGCAC CAGG CGGCCGCG； APOE 388‑LDR‑M： CACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCAGATAGC CAACCC GAGCGCCT； qPCR‑正向引物： CG GTTTTGGCGCAGTGACG； qPCR‑反向引物： AG GCGCTCGGGTTGGCTATCT； 和APOE 526位点基因分型检测引物组： APOE 526‑RPA‑正向引物： CG GCTCCTCCGCGATGC CGATGACCT； APOE 526‑RPA‑反向引物： CT TCTGCAGGTCATCGGCATCGCG G； APOE 526‑LDR‑C： CGGTTTTGGCGCAGTGACGC CCCGGCCTGGTACACTC  CAGGCG； APOE 526‑LDR‑T： CGGTTTTGGCGCAGTGACGC CCCGGCCTGGTACACTG  CAGGCA； APOE 526‑LDR‑M： CTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCG GAGATAGC CAACCC GAGCGCCT； qPCR‑正向引物： CG GTTTTGGCGCAGTGACG； qPCR‑反向引物： AG GCGCTCGGGTTGGCTATCT。 2.一种用于检测APOE基因多态性的试剂盒， 所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组 和探针。 3.一种用于检测人APOE  388位点基因分型的方法， 包括以下步骤： (1)利用特异性扩增引物APOE  388‑RPA‑正向引物和APOE  388‑RPA‑反向引物， 使用RPA 反应体系扩增APOE  388位点基因片段； (2)利用探针APOE  388‑LDR‑T、 APOE 388‑LDR‑C和APOE 388‑LDR‑M， 使用LDR反应体系 对步骤(1)扩增产物进行处 理； (3)利用qPCR扩增引物qPCR ‑正向引物和qPCR ‑反向引物， 使用qPCR反应体系对步骤(2) 的反应产物判别基因分型 结果。 4.根据权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中RPA反应体系中包含以下组 分， 2 μL模板， AP OE 388‑RPA‑正向引物(10 μM)、 AP OE 388‑RPA‑反向引物(10 μM)各2 μL， 所述 模板为提取的患者DNA； 优选地， 所述步骤(1)RPA反应程序为： 添加2.5 μL浓度为280mM的乙 酸镁启动反应， 并在37℃孵 育30min。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)LDR反应体系包含以下组分， APOE 388‑LDR‑T(30nM)或APOE  388‑LDR‑C(30nM)1 μL， APOE  388‑LDR‑M(30nM)1 μL， 10 ×Taq 权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115505634 A 2DNA Ligase Buffer 1 μL， Taq DNA Ligase(30U/ μL)0.25 μL， RPA扩增产物1 μL， 超纯水5.75 μ L； 优选地， 所述步骤(2)LDR反应程序为： 混合反应物瞬时离心后， 先在95℃变性3min， 接着 在60℃连接5min。 6.根据权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)qPCR反应体系包括以下组分， MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 10 μL， qPCR ‑正向引物0.4 μL， qPCR ‑反向引物0.4 μL， 模板1 μL， 超 纯水8.2 μL； 优选地， 所述步骤(3)qPCR反应程序为： 在9 5℃预变性10min， 在9 5℃变性10s， 在 60℃下退火和延伸3 0s， 40个循环。 7.一种用于检测人APOE  526位点基因分型的方法， 包括以下步骤： (1)利用扩增引物APOE  526‑RPA‑正向引物和APOE  526‑RPA‑反向引物， 使用RPA 反应体 系扩增APOE  526位点基因片段； (2)利用探针APOE  526‑LDR‑C、 APOE 526‑LDR‑T和APOE 526‑LDR‑M， 使用LDR反应体系 对步骤(1)扩增产物进行处 理； (3)利用qPCR扩增引物qPCR ‑正向引物和qPCR ‑反向引物， 使用qPCR反应体系对步骤(2) 的反应产物判别基因分型 结果。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)RPA反应体系中包含以下组 分， 2 μL模板， AP OE 526‑RPA‑正向引物(10 μM)、 AP OE 526‑RPA‑反向引物(10 μM)各2 μL， 所述 模板为提取的患者DNA； 优选地， 步骤(1)RPA反应程序为： 添加2.5 μL浓度为280mM的乙酸镁 启动反应， 并在37℃孵 育30min。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)LDR反应体系包含以下组分， APOE 526‑LDR‑C(30nM)或APOE  526‑LDR‑T(30nM)1 μL， APOE  526‑LDR‑M(30nM)1 μL， 10 ×Taq  DNA Ligase Buffer 1 μL， Taq DNA Ligase(30U/ μL)0.25 μL， RPA扩增产物1 μL， 超纯水5.75 μ L； 优选地， 所述步骤(2)LDR反应程序为： 混合反应物瞬时离心后， 先在95℃变性3min， 接着 在60℃连接5min。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)qPCR反应体系包括以下组 分， MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 10 μL， qPCR ‑正向引物0.4 μL， qPCR ‑反向引物0.4 μL， 模板1 μ L， 超纯水8.2μL； 优选地， 所述步骤(3)qPCR反应程序为： 在95℃预变性10min， 在95℃变性 10s， 在60℃下退火和延伸3 0s， 40个循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115505634 A 3