(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210698051.0 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 广东永诺医疗科技有限公司 地址 528000 广东省佛山市禅城区塱宝西 路82号第八层 (72)发明人 冼伟杰　罗景燕　蔡贞　许少飞　 孔敏宜　朱丽敏　叶月娥　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 许东辉 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于 检测JC病毒的引物、 探 针及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测JC病毒的引物、 探针及试剂盒， 属于生物技术领域。 本发明用于 检测JC病毒的试剂盒包括特异性引物对和特异 性探针； 所述特异性引物对的序列如SEQ  ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示； 所述特异性探针的序列如 SEQ ID NO:3所示。 本发明的用于检测JC病毒的 引物、 探针及试剂盒以微滴数字PCR技术为依托， 能够在短时间内实现JC病毒的快速、 精准定量， 为JC病毒感染相关疾病的病毒载量监测提供有 力的技术支持， 有着广阔的应用前景和产业化前 景。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 115216563 A 2022.10.21 CN 115216563 A 1.一种用于检测JC病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括特异性引物对和特异 性探针； 所述特异性引物对的序列如SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2所示； 所述特异性探针的 序列如SEQ  ID NO:3所示。 2.根据权利要求1所述的用于检测JC病毒的试剂盒， 其特征在于， 还包括内标引物对和 内标探针； 所述内标引物对的序列如SEQ  ID NO:4和SEQ  ID NO:5所示； 所述内标探针的序 列如SEQ ID NO:6所示。 3.根据权利要求1或2所述的用于检测 JC病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述探针的5 ’端 标记有荧 光基团， 3 ’端标记有淬灭基团。 4.根据权利要求3所述的用于检测JC病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光基团选自 FAM、 VIC/HEX、 ROX、 CY3、 CY5、 CY5.5、 CY7、 JOE、 TAMRA、 TET、 Texas  Red、 Quasar  570、 Quasar   670、 Atto 425、 Atto 590或Alexa  Flour系列荧光修饰基团中的至少一种； 所述淬灭基团选 自Dabcyl、 E clipse、 MGB、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 B BQ 650、 TAMRA或TQ1 ‑TQ7系列中的至少一种。 5.根据权利要求1所述的用于检测JC病毒的试剂 盒， 其特征在于， 包括JC病毒检测反应 液、 对照品、 PCR用酶混合液和内标物； 所述JC病毒检测反应液包括检测buffer、 dNTPs、 特异 性引物对、 特异性探针， 内标引物对和内标探针； 所述PCR用酶混合液包括taq酶、 UDG酶和内 切酶。 6.根据权利要求5所述的用于检测JC病毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述内标引物对在JC 病毒检测反应液中的浓度为90 0nM， 所述内标探针在JC病毒检测反应液中的浓度为375nM 。 7.根据权利要求5所述的用于检测JC病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述对照品包括阳性 对照品和阴性对照品； 所述阳性对照品为含有JC病毒的阳性尿液稀释制备而成； 所述阴性 对照品为 正常人混合阴性尿液。 8.根据权利要求5所述的用于检测JC病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述内标物为人工合 成的外源重组质粒。 9.根据权利要求1～8任一项所述的试剂盒在定量检测JC病毒中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述定量检测的样本包括血清、 血浆或尿 液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115216563 A 2一种用于 检测JC病毒 的引物、 探针及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 具体涉及一种用于检测JC病毒的引物、 探针及试剂盒。 背景技术 [0002]JC病毒与1971年首次从一位PML患者的脑中分离发现， 并以该患者的名字John   Cunningham命名， JC病毒感染可能会引起PML， 这是一种较为罕见的和免疫损伤结合的脱髓 鞘疾病。 PML经常发生于免疫系统功能严重抑制的人群， 主要包括HIV感染、 淋巴组织增生、 器官移植等病患。 早期研究表明， JC病毒感染而导致的P ML比较罕见， 但是随着HIV感染率逐 年增高， AIDS患者 感染JCV导致PML的病例呈现上升趋势， 有研究发现JCV和HIV在分子、 细胞 核免疫水平都有着明显的相互作用， 因此HIV和JCV可能存在某种协同作用共同导致PML的 发生。 此外， JCV感染还 可使肾移植患者发生PVAN， 该病是影响移 植肾功能的主要因素之一， 目前没有有效的治疗手段。 国外的相关调查表明， 10～14岁的儿童 感染率约为65％， 50～59 岁的成人感染率达到75％， 80％以上成年人JC病毒抗体阳性。 大多数人感染JC病毒后没有 明显症状。 一般认为， JC病毒感染人体扁桃体中的细胞， 通过在淋巴细胞中复制进行扩散， JC病毒还能在肾脏组织中复制， 并通过尿液排除病毒， 故一般成年人尿液中可以检测 到JC 病毒。 [0003]JC病毒颗粒呈球状， 正二十面体对称， 为闭合环状双链D NA病毒， 无囊膜， 基因组全 序列已于1993年全部测序完成， 全长5130bp。 JC病毒的感染途径主要为食用被污染的水或 食物， 其感染过程包括吸附、 穿膜、 入核、 脱衣壳、 病毒DNA的释放及启动早期基因转录。 随着 病毒DNA的复制， 晚期启动子激活衣壳蛋白VP1、 VP2和Agno蛋白， 包装 呈病毒颗粒， 最终导致 细胞裂解死亡。 基于病毒学特性， 对于JC病毒的检测主要集中于病毒核酸检测和病毒蛋白 检测， 不同的检测方法各有优劣， 目前 的研究表明， 对病毒的检测一般包括两个方面， 一是 病毒的成分， 如病毒核酸或者病毒蛋白质， 二是机体免疫系统所产生的特异 性抗体。 在病毒 学上， 如果患者样本中能检出病毒核酸或蛋白就说明患者已感染了该病毒， 而对抗体的检 测则只代表患者是否被病毒感染过， 不能确认是否为现症感染。 对于JC病毒的检测， 现阶段 使用的检测方法主要有 血清学检测、 形态学检测和分子生物学检测三类。 免疫诊断： JC病毒 与同族的JC病毒和SV 40病毒的基因组及编码蛋白有很大的相似性， 因此JC病毒 血清学检测 需要特异性的抗体， 该方法操作简单， 对实验设备要求较低， 但容易受到实验器材、 反应温 度、 缓冲罐体系等因素的影响而使反应结果不准确 。 形态学检测： 主要包括免疫组化(IHC) 和原位杂交(ISH)， 研究发现， 用IHC和ISH技术同时检测相同的已感染JC病毒的样本， 结果 显示IHC比ISH更敏感， 但IHC检测只能判断为早期或潜在感染。 分子生物学检测方法： 基于 分子生物学 的检测方法由于其具有特异性强、 准确 率高等特点， 是传染疾病诊断以及病原 体检测最可靠的检测方法之一， 随着JC病毒基因组全序列的获得， 使得基于病毒核酸序列 的分子生物学检测方法广泛应用。 分子生物学检测方法主要采用PCR技术平 台， 传统的PCR 检测， 如巢式P CR、 实时PCR、 荧光定量PCR等方法， 但由于JC病毒的基因组具有很强的变异性 且样本浓度范围大， 存在极低浓度的情况， 因此传统P CR的检测方法容易使 得检测结果呈现说　明　书 1/9 页 3 CN 115216563 A 3