(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221071396 3.0 (22)申请日 2022.06.22 (66)本国优先权数据 202210530059.6 202 2.05.16 CN (71)申请人 纳昂达 （南京） 生物科技有限公司 地址 210000 江苏省南京市江北新区华康 路142号南京生物医药谷加速器三期 A01栋南侧3 -4层 (72)发明人 余丽萍　汪彪　吴强　冀长泉　 李晨　 (74)专利代理 机构 南京华讯知识产权代理事务 所(普通合伙) 32413 专利代理师 刘怡彣 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) G16B 25/20(2019.01) (54)发明名称 一种用于检测HPV的液相杂交捕获探针、 应 用及其试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种用于检测HPV的杂交捕获 探针、 方法及其试剂盒。 设计覆盖多个亚型基因 组的探针， 其主要由探针 之间互补配对的片段以 及探针与靶区域互补配对的片段组成， 探针的3 ’ 端或5’端有生物素修饰。 该探针以病毒基因组为 模板进行捕获， 允许检测少于1个拷贝的病毒基 因组， 提高病原体检测 效率， 并实现单管探针中 检测多个病毒亚型的目的， 且可以用于检测HPV 分型。 本发明通过优化探针设计方案、 杂交捕获 系统， 提高探针与靶区域的结合能力、 微量靶标 的杂交捕获效率， 以及提升整体的覆盖均一性以 及稳定性。 权利要求书2页 说明书23页 序列表71页 附图3页 CN 115011594 A 2022.09.06 CN 115011594 A 1.一组用于检测HPV的探针， 其特征在于， 所述探针包括： (1)与另一探针互补配对的探 针结合序列， 以及(2)与HPV病原体序列互补配对的靶特异性序列。 2.根据权利要求1所述的探针， 其特征在于， 所述探针结合序列包括第 一探针结合序列 和第二探针结合序列。 3.根据权利要求2所述的探针， 其特征在于， 所述探针的5 ’端具有与另一探针的3 ’端互 补配对的第一探针结合序列， 并且所述探针的3 ’端具有与另一探针的5 ’端部互补配对的第 二探针结合序列。 4.根据权利要求1所述的探针， 其特 征在于， 所述靶特异性序列的长度为20 ‑80nt。 5.根据权利要求1所述的探针， 其特 征在于， 所述探针结合序列的长度为8 ‑30nt。 6.根据权利要求3所述的探针， 其特征在于， 所述探针5 ’端与另一探针互补配对的第一 探针结合序列长度为8 ‑30nt， 所述探针3 ’端与另一探针互补配对的第二探针结合序列长度 为8‑30nt。 7.根据权利要求1所述的探针， 其特 征在于， 所述探针的3 ’端或5’端带有生物标记 物。 8.根据权利要求7 所述的探针， 其特 征在于， 所述 生物标记 物为生物素。 9.根据权利要求1 ‑8的探针在制备用于HPV检测试剂中的应用， 其特征在于， 所述探针 可以透过杂交捕获的方式进行检测。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 所述杂交捕获包括如下步骤： (1)杂交捕获 i.配置杂交体系： 所述杂交体系包 含所述探针； ii.杂交反应： 将所述杂交体系置 于55～65℃进行杂交1～ 2小时； (2)产物捕获： 杂交反应结束后， 反应 体系中加入链霉亲和素磁珠进行杂交捕获； (3)产物洗脱： 捕获结束后， 使用洗脱缓冲液I、 洗脱缓冲液I I 以及洗脱缓冲液I II各洗涤1次； (4)产物扩增纯化： 洗涤结束后， 加入PCR反应体系， 进行PCR扩增程序， 反应结束后， 使 用磁珠进行 纯化。 11.根据权利要求10所述的应用， 其特征在于， 所述杂交体系中包含2 ‑10fmol的探针、 1 ×Hyb Buffer、 1×Enhance、 1 μg  Human Cot‑1， 以及10 0pmmol的Blocker。 12.根据权利要求10所述的应用， 其特征在于， 所述杂交反应的条件为95℃变性2分钟、 60℃杂交1小时。 13.根据权利要求10所述的应用， 其特征在于， 所述产物捕获的条件为60℃捕获20分 钟。 14.根据权利要求10所述的应用， 其特征在于， 所述洗脱缓冲液I的配方为5 ×SSPE、 0.5％～5％SDS； 所述洗脱缓冲液II的配方为2 ×SSPE、 0.05％～0.5％SDS； 所述洗脱缓冲液 III的配方为0.1 ×SSPE、 0.005％～0.0 5％SDS。 15.一种用于检测HPV的杂交捕获试剂盒， 其特征在于， 包括如下组分： 探针、 杂交反应 液、 洗脱缓冲液、 链霉亲和素磁珠、 核酸纯化磁珠； 所述探针包括与另一探针互补配对的探 针结合序列以及与HPV病原体序列互补配对的靶特异性序列。 16.根据权利要求14所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括末端修复酶混合 物、 末端修复反应缓冲液、 含分子标签的接头、 文库扩增引物、 PCR预混液、 接头封闭剂、 DNA权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115011594 A 2封闭剂、 杂交增强剂、 磁珠洗涤液、 捕获文库PCR引物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115011594 A 3