(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210726997.3 (22)申请日 2022.08.31 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新 技术开发 区科学大道100号 (72)发明人 彭颖　李冬月　郭葳　尚剑　王洁　 李玥颖　张旗　汤文学　郭永军　 (74)专利代理 机构 北京正华智诚专利代理事务 所(普通合伙) 11870 专利代理师 何凡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于快速核酸检测的体系、 扩增方法及 试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种用于快速核酸检测的体 系、 扩增方法及试剂盒， 该扩增方法包括如下步 骤： 配置混合液A、 混合液B和混合液C， 将混合液 B、 混合液C和混合液A依次加入PCR管内混匀后扩 增； 该方法能够解决现目前快速核酸检测技术中 假阳性率较高和有效检测浓度范围较窄的技术 问题。 权利要求书1页 说明书7页 附图9页 CN 115354069 A 2022.11.18 CN 115354069 A 1.一种用于快速核酸检测的体系， 其特征在于， 包括CoOOH、 修饰模板序列和触发序列； 所述CoOOH、 修饰模板序列和触发序列的体积比为(0.9 ‑1.1):(0.7 ‑0.8):(2.5 ‑3.5)； 所述修饰模板序列的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述触发序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的用于快速核酸检测的体系， 其特征在于， 包括混合溶液A、 混合 溶液B和混合溶液C， 所述混合液A包括水、 10 ×等温缓冲液、 BSA、 Bst  DNA聚合酶和 NT.BstNBI内切酶， 所述水、 10 ×等温缓冲液、 Bst  DNA聚合酶和NT.BstNBI内切酶的体积比 为(2.5‑3.0):(4.5 ‑5.0):(3.5 ‑4.0):(0.7 ‑0.8)； 所述 混合液B包括水、 10 ×等温缓冲液、 修 饰模板序列、 MgSO4、 dNTPs、 20 ×SYBR GreenⅠ、 T4 gp32蛋白和CoOOH， 所述水、 10 ×等温缓冲 液、 修饰模板序列、 MgSO4、 dNTPs、 20 ×SYBR GreenⅠ、 T4 gp32蛋白和CoOOH的体积比为(5.0 ‑ 5.5):(2.0 ‑3.0):(0.7 ‑0.8):(2.2 ‑2.5):(1.4 ‑1.6):(0.7 ‑0.8):(0.2 ‑0.4):(0.9 ‑1.1)； 所 述混合液C包括所述触发序列， 所述混合溶 液C与所述混合溶 液A的体积比为(2.5 ‑3.5):10。 3.根据权利要求2所述的用于快速核酸检测的体系， 其特征在于， 所述10 ×等温缓冲液 包括200mM  Tris‑HCl、 100mM  KCl、 100mM(NH4)2SO4、 20mM MgSO4和1％Triton  X‑100， 所述 Tris‑HCl的pH为8.8。 4.一种如权利要求2或3所述的用于快速核酸检测的扩增方法， 其特征在于， 包括如下 步骤： 配置所述混合液A、 所述混合液B和所述混合液C， 将所述混合液B、 所述混合液C和所述 混合液A依次加入PCR管内混匀后扩增。 5.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法， 其特征在于， 所述扩增的程序 为： 20‑30℃、 12‑18s； 45‑55℃、 10s、 180个 循环、 每8 ‑12s测一次荧 光。 6.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法， 其特征在于， 在所述混合液A 中， 所述BSA的初浓度为3.5 ‑4.5mg/ml， 所述B st DNA聚合酶的初浓度为7.5 ‑8.5U/ μL， 所述 NT.BstNBI内切酶的初浓度为 4.5‑5.5U/ μL。 7.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法， 其特征在于， 在所述混合液B 中， 所述修饰模板序列的初浓度为0.8 ‑1.2 μM， 所述MgSO4的初浓度为80 ‑120mM， 所述dNTPs 的初浓度为8 ‑12mM， 所述T4  gp32蛋白的初浓度为380 ‑420ng/μL， 所述CoOOH的初浓度为 0.8‑1.2 μg/ μL。 8.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法， 其特征在于， 在所述混合液C 中， 所述触发序列的初浓度为10 0fM‑100nM。 9.根据权利要求4所述的用于快速核酸检测的扩增方法， 其特征在于， 所述混合溶液A、 混合溶液B和混合溶 液C均在冰上配制。 10.一种用于快速核酸检测的试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1 ‑3任意一项所述 的用于快速核酸检测的体系。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115354069 A 2一种用于快速核酸检测的体系 、 扩增方法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于核酸检测技术领域， 具体公开了一种用于快速核酸检测的体系、 扩增 方法及试剂盒。 背景技术 [0002]适合用于现场检测、 临床诊断的快速、 高通量核酸检测技术是急于被需要的。 目前 已开发了多种特定核酸靶标检测方法， 比如实验室最常用的聚合 酶链式反应P CR， 它利用耐 热DNA聚合酶， 通过三组不同反应的扩增周期来实现特定DNA靶标的指数级扩增 。 这三种反 应发生在不同温度下， 因此P CR需要精密的热循环系统， 但这种大型且昂贵的仪器需要限制 了它在资源有限的现场诊断、 非专 业场所的应用。 由于扩增子长度和DNA聚合酶反应速度的 限制， 反应时间较长。 此外， 检测病毒RNA时需要额外的反转录即将RNA分子逆转录为cDNA， 再用进行扩增过程， 这增加了样品处理和污染风险， 并且整个过程所需要时间较长。 这些传 统的核酸检测方法存在复杂的样品处理、 消耗昂贵试剂、 检测量小、 所需时间长等缺点， 阻 碍了基于PCR的分子诊断在需要非常快的分析持续时间、 大样本量和有限资源的情况下 的 应用， 有待进一步的优化和完 善。 [0003]近年来开发的简单、 灵活、 快速的等温核酸扩增技术具有扩增能力优异、 反应方案 简单、 所需样品量少等优点， 弥补了PCR的一些不 足， 即不需热循环， 使用简单、 便携的仪器。 等温扩增 技术是通过目标核酸分子来触发下游级联反应， 从而产生放大信号， 所需反应时 间大大缩短。 因此， 这些优点使等 温核酸扩增技术在快速现场分析中具有显著优势， 被广泛 应用， 并成为有很高前景的PCR技术的替代方法。 其中， 指数扩增反应EXPAR  由于其扩增子 长度比大多数等温核酸扩增方法的扩增子 短， 可在几分钟内将一段短寡核苷酸即触发序列 指数放大， 在短时间内具有较高的扩增效率而从众多等 温核酸扩增技术中脱颖而 出。 EXPAR 反应使用较少的酶和蛋白质， 在中等 温度下进 行， 只需一个模板(X` ‑X`模板： 其序列由两个 拷贝的触发序列X 的互补序列组成， 中间由产生切割酶识别和切割位点的少数碱基隔开)。 EXPAR反应的核心由触发序列X引发， 当触发序列X与单链模板杂交时， 由DNA聚合酶延伸形 成完整双链， 然后缺口内切酶切割顶链， 聚合酶的链置换活性释放出另一个相同的触发序 列X。 这些新形成的触发序列X启动新一轮的扩增， 形成类似分子链式反应(一个反应的产 物 催化生成相同产物的进一步反应)， 实现指数扩增， 可用特异性染料SYBR  Green 实时监测 扩增过程。 由于EXPAR具有快速、 等温、 高扩增效率、 高灵敏度等特点， 已被用于病毒与 miRNA、 酶活性、 蛋白质等靶标的检测。 [0004]最近开发了一种新的、 无需逆转录(RTF)、 更快速、 更简单的检测新冠病毒SARS ‑ CoV‑2的等温扩增方法， 称为RTF ‑EXPAR。 该方法利用核酸内切酶B stNI在病毒RNA与Binder   DNA X形成杂合DNA/RNA双链时切割DNA链， 生成触发序列X， 触发下游EXPAR反应， 从而放大 病毒检测信号， 避免了漫长的逆转录步骤， 在一个体系里面完成RNA向DNA的转换和扩增步 骤即“一步法”设置， 该方法的检测时间、 灵敏度均优于实验室常用的RT ‑qPCR和针对SARS ‑ CoV‑2开发的LAMP方法。说　明　书 1/7 页 3 CN 115354069 A 3