(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210670447.4 (22)申请日 2022.06.14 (71)申请人 武汉市景肽生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新大道888号高农生物园总部B 区20#楼3层316号房 (72)发明人 杨燕宇　谭超　侯静　罗辉　 赵建华　 (74)专利代理 机构 武汉天领众智专利代理事务 所(普通合伙) 42300 专利代理师 刘诚 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于基因多态性分型的鉴定方法及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于基因多态性分型的 鉴定方法及其应用， 包括如下步骤： S1、 根据待检 测样品中不同多态性位点的基因序列， 分别设计 两条对应所述不同多态性位点的特异性引物 ASP1和ASP2， 以及一条通用反向引物LSP； S2、 分 别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额 外序列GC ‑add和AT ‑add， 并且所述特异性引物 ASP1和ASP2的3＇ 末端碱基分别和待检测样品中 的不同多态性位点匹配； S3、 配制PCR反应体系， 加入相应 试剂后， 进行AS ‑PCR扩增反应； S4、 扩增 反应完成后， 通过熔解曲线分析， 即可完成对待 检测样品基因分型鉴定。 本发明中通过调整GC ‑ add或AT‑add序列的长度和在引物中的嵌入位置 来平衡ASP1和ASP2的扩增效率， 从而成功消除杂 合基因型样品检测中的不均一扩增现象。 权利要求书3页 说明书21页 序列表14页 附图13页 CN 114958986 A 2022.08.30 CN 114958986 A 1.一种用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列， 分别设计两条对应所述不同多态 性位点的特异性引物 ASP1和ASP2， 以及一条通用反向引物LS P； S2、 分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列， 并且所述特异性引物 ASP1和ASP2的3＇ 末端碱基分别和待检测样品中的不同多态性 位点匹配； S3、 配制PCR反应 体系， 加入相应试剂后， 进行AS ‑PCR扩增反应； S4、 扩增反应完成后， 通过 熔解曲线分析， 即可完成对待检测样品基因分型鉴定 。 2.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 步骤S1中， 所 述特异性引物 ASP1和ASP2位于所述多态性 位点的上游或位于所述多态性 位点的下游。 3.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所 述额外序列插入的位置距离所述特异 性引物的3＇ 末端最短距离为 10个碱基， 最远可位于所 述特异性引物的5＇ 末端。 4.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所 述额外序列选自GC ‑add或AT‑add中的一种。 5.根据权利 要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述GC ‑add添 加在所述特异性引物 ASP1中， 所述AT ‑add添加在所述特异性引物 ASP2中。 6.根据权利 要求5所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述GC ‑add和 所述AT‑add分别在所述特异性引物ASP1和ASP2上的插入位点和3＇ 末端碱基的距离相同或 不同。 7.根据权利 要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述GC ‑add和 所述AT‑add的长度相同或不同。 8.根据权利 要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述GC ‑add和 所述AT‑add至少由如下物质中的一种组成： 1)核苷酸碱基； 2)核苷酸碱基 类似物； 3)化学修饰的核苷酸碱基。 9.根据权利 要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述GC ‑add的 长度为3～40bp， 并且所述GC ‑add中的鸟嘌呤碱基(G )和胞嘧啶碱基(C)所占比例不少于 60％。 10.根据权利要求4所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述AT ‑add 的长度为3～40bp， 并且所述AT ‑add中的腺嘌呤碱基(A)和胸腺嘧啶碱基(T)所占比例不少 于60％。 11.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 步骤S3 中， 所 述PCR反应体系包括两条对应所述不同多态性位点的特异性引物ASP1和ASP2、 一条通用反 向引物LS P、 缓冲体系 、 DNA聚合酶、 dNTPs、 待检测样品DNA以及荧 光染料。 12.根据权利要求11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述荧光染 料包括可以和双链DNA特异结合或 嵌入结合并产生 荧光信号的荧 光染料。 13.根据权利要求11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述待检测 样品DNA包括双链DNA、 单链DNA、 线性DNA、 环状DNA以及由RNA转录获得的cDNA。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114958986 A 214.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 步骤S4中， 所 述熔解曲线分析 过程中， 用于双链DNA解链的升温过程中升温速率 不低于1.5℃/分钟。 15.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述AS ‑PCR 扩增反应可在单 管中进行， 并且所述单 管中可以同时进行两个以上靶基因的分型检测。 16.根据权利要求1所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述基因多 态性分型的鉴定为复等 位基因多态性分型的鉴定 。 17.根据权利要求16所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述复等位 基因多态性分型的鉴定过程中， AS ‑PCR扩增反应可在单管中进行， 通过单管反应依次检测 复等位基因中的单个多态性位点或通过单管反应同时检测复等位基因中的多个多态性位 点， 从而完成复等 位基因多态性分型的鉴定 。 18.根据权利要求17所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述复等位 基因为水稻淀粉粒结合淀粉合成酶基因， 所述水稻淀粉粒结合淀粉合成酶基因差异化SNP 位点分别为 Int1‑1、 Ex4‑53、 Ex4‑77、 Ex6‑62和Ex10 ‑105。 19.根据权利要求18所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 所述检测 Int1‑1的引物序列如SEQ  ID NO:41‑45所示； 所述检测Ex4 ‑53的引物序列如SEQ  ID NO:46‑ 50所示； 所述检测Ex4 ‑77的引物序列如SEQ  ID NO:51‑55所示； 所述检测Ex6 ‑62的引物序列 如SEQ ID NO:56‑60所示； 所述检测Ex10 ‑105的引物序列如SEQ  ID NO:61‑65所示。 20.根据权利要求19所述的用于基因多态性分型的鉴定方法， 其特征在于， 还包括与 所 述Int1‑1的引物序列、 所述Ex4 ‑53的引物序列、 所述Ex4 ‑77的引物序列、 所述Ex6 ‑62的引物 序列和所述Ex10 ‑105的引物序列存在至少6 0％以上序列一 致性的引物。 21.一种用于基因多态性分型的鉴定系统， 其特 征在于， 包括如下模块： 信息获取模块： 根据待检测样品中不同多态性位点的基因序列， 分别设计两条对应所 述不同多态性 位点的特异性引物 ASP1和ASP2， 以及一条通用反向引物LS P； 引物设计模块： 分别在所述特异性引物ASP1和ASP2中嵌入一段额外序列， 并且所述特 异性引物ASP1和ASP2的3＇ 末端碱基 分别和待检测样品中的不同多态 性位点匹配， 即可得到 用于基因多态性分型的引物； PCR扩增反应模块： 配制PCR反应 体系， 加入相应试剂后， 进行AS ‑PCR扩增反应； 分析模块： 扩增反应完成后， 通过熔解曲线分析， 即可完成对待检测样品基因分型鉴 定。 22.根据权利要求21所述的用于基因多态性分型的鉴定系统， 其特征在于， 所述引物设 计模块还包括引物相关参数优化模块， 所述引物相关参数优化模块用于对引物在模板上的 位置、 引物长度、 退火温度、 GC含量、 GC ‑add和AT‑add选择、 GC ‑add和AT‑add在引物上的插入 位点进行优化。 23.一种用于基因多态性分型的引物， 其特征在于， 由权利要求21所述的引物设计模块 设计得到 。 24.一种用于基因多态性分型的检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1或权利要求 11所述的用于基因多态性分型的鉴定方法中的PCR反应 体系。 25.权利要求1～20任一项所述的用于基因多态性分型的鉴定方法在等位基因多态性 分型检测中的应用。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114958986 A 3