(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210617332.9 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 山东大学 地址 250199 山东省济南市历城区山大南 路27号 (72)发明人 徐晓文　葛婧雯　 (74)专利代理 机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 专利代理师 孙振家 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于SARS-CoV -2检测的DNA步行器及其 制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种用于SARS ‑CoV‑2检测的DNA 步行器及其制备方法。 所述用于SARS ‑CoV‑2检测 的DNA步行器包括行走链W、 锁定链L1、 锁 定链L2、 轨道链Tr、 靶标链T1、 靶标链T2和纳米 金粒子。 本 发明还提供该DNA步行器的制备方法， 以及利用 该DNA步行器检测SARS ‑CoV‑2的方法。 本发明提 供的DNA步行器实现了可视化的SARS ‑CoV‑2检 测， 并且具有干扰因素少、 价格便宜和稳定性好 的优点， 同时灵敏度能够达到1nM。 利用本发明的 DNA步行器或试剂盒进行检测时， 不需要逆转录 步骤， 避免了酶、 标记或修饰的使用， 结果可视 化， 减少了对复杂设备的需求， 为SARS ‑CoV‑2病 毒检测提供一种方便、 经济、 快速、 可靠的方法。 权利要求书2页 说明书9页 附图6页 CN 114875180 A 2022.08.09 CN 114875180 A 1.一种用于SARS ‑CoV‑2检测的DNA步行器， 其特征在于， 所述DNA步行器包括行走链W、 锁定链L1、 锁定链L2、 轨道 链Tr、 靶标链T1、 靶标链T2和纳米金 粒子； 所述行走链W的核苷酸序列为： 5' ‑HS‑(T)42TGGTTCAATCTGTCAATCTCTTCTCCGAGCCGGTCG AAATAGTCCATAACCTTTCCACA‑3'； 所述锁定链L1的核苷酸序列为： 5' ‑TGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGACTA‑3'； 所述锁定链L2的核苷酸序列为： 5' ‑AAGAGATTGACAGAT TGAACCAGCTTGAG‑3'； 所 述轨 道链T r的 核苷酸 序列为 ； 5 ' ‑H S‑(T)6GG C TG TGG AC TAT/ rA/ GGAAGAGATTCAGCCCGCGTTTTTTTCGCG‑6‑Carboxyfluorescei n(FAM)‑3'； 所述靶标链T1的核苷酸序列为： 5' ‑CCATAACCTTTCCACATACCGCA‑3'； 所述靶标链T2的核苷酸序列为： 5' ‑CTCAAGCTGGTTCAATCTGTCA A‑3'。 2.如权利要求1所述的用于SARS ‑CoV‑2检测的DNA步行器， 其特征在于， 所述纳米金粒 子的制备 方法如下： 配制浓度为38.8mM的柠檬酸钠水溶液， 配制浓度为1mM的HAuCl4水溶液； 将HAuCl4水溶 液加热至沸腾， 然后一边搅拌一边将柠檬酸钠水溶液加入至HAuCl4水溶液中， 在加热沸腾 状态下， 反应10mi n， 反应完成后再搅拌15mi n， 冷却至25℃， 过 滤， 得到纳米金 粒子(AuNPs)。 3.一种SARS ‑CoV‑2检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA步 行器和MgCl2溶液。 4.如权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中DNA步行器的工作浓度 为3nM， MgCl2溶液的工作浓度为180mM 。 5.权利要求1所述的用于SARS ‑CoV‑2检测的DNA步行器的制 备方法， 其特征在于， 包括 步骤如下： (1)将行走链W、 锁定链L1和锁定链L2在退火缓冲液中混合均匀， 然后在95℃加热 10min， 冷却至20～30℃， 得到完全封闭的行走链； 再将完全封闭的行走链和TCEP孵育2h， 得 到巯基化完全封闭的行 走链； (2)将轨道 链Tr在95℃加热10mi n， 得到退火后的轨道 链Tr； (3)将AuNPs、 巯基化完全封闭的行走链和退火后的轨道链Tr混合均匀， 然后在4℃避光 下孵育16h， 接着按照40min的时间间隔继续添加NaCl溶液至使NaCl终浓度为0.2M， 再于4℃ 避光下孵 育24h， 经离心洗涤后得到用于SARS ‑CoV‑2检测的DNA步行器。 6.如权利 要求5所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述行走链W、 锁定链L1和锁 定链L2的摩尔比为1:3:3 。 7.如权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述完全封闭的行走链和 TCEP的摩尔比为1:5 0。 8.如权利 要求5所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述AuNP s、 巯基化完全封闭 的行走链和退火后的轨道 链Tr的摩尔比为1:20:20 0。 9.利用权利要求1所述的DNA步行器检测SARS ‑CoV‑2的方法， 其特征在于， 包括步骤如 下： 将待检测样本加入到DNA步行器终浓度为3nM的缓冲液中， 在20～30℃下反应2.5～ 3.5h后添加CaCl2， 当孵育液显示 紫色， 则待测样本中包 含SARS‑CoV‑2。 10.如权利要求9所述的检测SARS ‑CoV‑2的方法， 其特征在于， 所述CaCl2在缓冲液中的权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875180 A 2终浓度为180mM 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875180 A 3