(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210569433.3 (22)申请日 2022.05.24 (71)申请人 南京邮电大 学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区文苑路9 号 (72)发明人 宋春元　翟佳赟　汪联辉　 (74)专利代理 机构 南京正联知识产权代理有限 公司 32243 专利代理师 姜梦翔 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6825(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/11(2006.01) G01N 21/65(2006.01) G01N 27/26(2006.01) (54)发明名称 一种用于miRNA检测的SERS-电化学双模传 感器、 其制备方法及其应用 (57)摘要 一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传 感器、 其制备方法及其应用， 通过提取亚甲基蓝 MB的SERS特征峰强度实现SERS传感模式， 通过方 波伏安法测试MB峰值电流实现电化学传感模式， 包含传感基底、 第一试剂、 第二试剂和第三试剂； 传感基底通过在银纳米棒阵列基片表面修饰发 夹型DNA单链和辅助链得到， 当目标miR ‑106a （T） 存在时， 与第一试剂DNAzyme和传感基底中辅助 单链LW在基底表面形成稳定LW/T/DNAzyme三链 复合物； 之后在第二试剂Zn2+的激活下， 触发第 一试剂在基底表面对传感基底中发夹型DNA单链 H1切割， 切割后剩余H1片段进一步结合修饰有信 号分子亚甲基蓝MB的SERS/电化学双模探针， 进 而输出SERS与电化学信号。 本双模传感器检测血 清中miR‑106a分别达到阿摩尔级和飞摩尔级， 满 足高灵敏和可靠 检测需求。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图4页 CN 114891889 A 2022.08.12 CN 114891889 A 1.一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器， 其特征在于： 所述双模传感器包含 传感基底、 第一试剂、 第二试剂和第三试剂探针四部分结构； 所述传感基底为修饰有发夹型DNA单链H1和辅助单链LW的基底， 其中基底为覆盖了一 层开有小孔的聚二甲基硅氧烷层的银纳米棒阵列基片； 所述小孔的孔径为 4mm， 高度为1m m； 所述第一试剂为DNAzyme； 所述第二试剂为氯化锌Zn2+溶液； 所述第三试剂双模探针为表面修饰有发夹型DNA单链H2和亚甲基蓝MB的二硫化钼基复 合纳米材 料MoS2@PDA‑Ag， MPA。 2.根据权利要求1所述的一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器， 其特 征在于： 所述发夹型DNA单链H1碱基序列如SEQ  ID NO： 1所示： 5 ’ ‑CCA CCT CAT TGA AAT ATG  CAG ACG TTG AAG GAT CGT CTT TAC AGG CGG AGG TGG TTT‑SH‑3’； 所述辅助单链LW碱基序列如SEQ  ID NO： 3所示： 5 ’ ‑GTA AGC ACT TTT ATG TGA TTT T‑ SH‑3’； 所述DNAzyme碱基序列如SEQ  ID NO： 4所示： 5 ’ ‑GAC GAT CTA GTT GAG CTG TCT GCA  TTT TTT TTT TTT CTA CCT GCA CT‑3’； 所述发夹型DNA单链H2碱基序列如SEQ  ID NO： 5所示： 5 ’ ‑SH‑TTT GGA TCG TCT TTA  CAG GCG CCA CCT CCG CCT GTA AAG ACG ATC C‑3’； 所述二硫化钼基复合纳米材料MoS2@PDA‑Ag是在MoS2纳米片MoS2 NSs上依次修饰聚多 巴胺和银纳米颗粒AgNPs得到 。 3.根据权利要求1所述的一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器， 其特 征在于： 目标miRNA ‑106a的碱基序列如SEQ  ID NO： 2所示： 5 ’ ‑AAA AGT GCT TAC AGT GCA GGT  AG‑3’； 针对目标miRNA ‑106a碱基序列检测的特异性实验对应的单碱基错配SM、 及完全错配即 miRNA‑21和miRNA ‑155的核酸碱基序列为： 单碱基错配序列SM的碱基序列如SEQ  ID NO： 6所示： 5 ’ ‑AAA AGT GCT TAC AGT GCA  AGT AG‑3′； 完全错配序列miRNA ‑21的碱基序列如SEQ  ID NO： 7所示： 5 ’ ‑UAG CUU AUC AGA CUG  AUG UUG A‑3’； 完全错配序列miRNA ‑155的碱基序列如SEQ  ID NO： 8所示： 5 ’ ‑UUA AUG CUA AUC GUG  AUA GGG GU‑3’。 4.一种如权利要求1 ‑3所述的用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器的制备方法， 其特征在于： 所述制备 方法的步骤如下： 步骤1， 制备双模传感基底： 将经90℃～95℃退火而得的发夹型DNA  H1和辅助单链LW混合并与银纳米棒阵列基片 共培养， 两种单链通过巯基与银纳米棒(AgNRs)形成Ag ‑S共价键连接在基片表面； 此外， 使 用巯基己醇(M CH)封闭基片表面剩余的位 点， 制备得到双模传感基底； 步骤2， 制备第一试剂： 根据辅助单链L W和目标序列设计并合成DNAzyme； 步骤3， 制备第二试剂：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891889 A 2制备第二试剂为氯化锌Zn2+溶液； 步骤4， 制备第三试剂： 根据发夹型DNA单链H1设计并合成发夹型DNA单链H2， MPA与聚乙烯吡咯烷酮PVP预混合 后加入信号分子MB混合并共培养过夜， 8000rpm  20min离心提纯两次， 去除上清液， 得到 MPA@MB， 将经90℃～95℃退火而得的发夹型DNA  H2和MPA@MB混合并共培养过夜， 得到最终 产物MPA@MB ‑H2双模探针； 步骤5， SERS ‑电化学双模传感器的制备： 在目标miRNA存在下， 目标的部分序列与传感基底中的辅助单链LW相互杂交， 另一部分 与第一试剂DNAzyme相互杂交形成LW/T/DNAzyme三链 复合结构并被固定在传感基底上。 加 入第二试剂Zn2+进行诱导下， 触发DNAzyme对基底表面的发夹型DNAH1的裂解和自身释放的 不断walker重复过程； 裂解后剩余的H1序列与传感探针中的H2， 通过形成的H1 ‑H2双链将第 三试剂双模探针MPA@MB ‑H2捕获组装在基底表面； 通过同时输出MB的SERS和电化学信号实 现双模检测。 5.根据权利要求4所述的一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器制备方法， 其 特征在于： 所述 步骤1中， 双模传感基底上H1与L W的浓度比为5： 1～ 20： 1。 6.根据权利要求4所述的一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器制备方法， 其 特征在于： 所述步骤5中， 目标序列与DNAz yme混合后与传感基底的培育时间为2h， 培育温度 为37℃。 7.根据权利要求4所述的一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器制备方法， 其 特征在于： 所述步骤5中， 第二试剂Zn2+培育浓度 为0.1mM～2mM； 时间为0.5h～2h， 培育温度 为37℃。 8.根据权利要求4所述的一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器制备方法， 其 特征在于： 所述 步骤5中， 第三试剂双模探针的培 育时间为1h； 培 育温度为37℃。 9.一种如权利要求1 ‑3所述的用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器的应用， 其特 征在于： 包括如下步骤： 步骤a， 在10％浓度的正常人 血清中加入目标序列miRNA ‑106a， 得到样品溶 液， 备用； 步骤b， 将 样品溶液替换PB缓冲液中的目标序列构建双模传感器； 步骤c， 将步骤b处理得到的样品清洗多次后进行SERS与电化学测试， 得到不同浓度目 标序列的SERS光谱及电化学SWV图谱， 以目标miRNA ‑106a浓度的对数为横坐标， 分别以MB的 特征峰的SERS强度和峰值电流 强度为纵坐标， 绘制SERS传感、 电化学传感的工作曲线， 根据 工作曲线计算传感器的SERS传感检出限和电化学传感检出限。 10.根据权利 要求9所述的一种用于miRNA检测的SERS ‑电化学双模传感器的应用， 其特 征在于： 所述步骤b中， SERS与电化学传感模式检测目标miRNA ‑106a浓度范围为100aM～ 1nM。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891889 A 3