(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211328783.7 (22)申请日 2022.10.27 (71)申请人 中国热带农业科 学院热带生物技 术 研究所 地址 571101 海南省海口市龙华区学院路4 号 (72)发明人 王文治　冯小艳　张树珍　王俊刚　 冯翠莲　赵婷婷　沈林波　 (74)专利代理 机构 深圳市千纳专利代理有限公 司 44218 专利代理师 张新蕊 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) A01H 4/00(2006.01) A01G 7/00(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法 (57)摘要 本发明提供了一种甘蔗抗条纹花叶病毒的 精准评价方法： 筛选感染单一SCSMV株系甘蔗材 料， 从中提取SCSMV病原液， 制备待评价甘蔗种质 无毒植株， 将等量病原液分别接种至无毒幼嫩植 株上， 筛选出感染SCSMV的甘蔗植株， 构建SCSMV 荧光定量PCR标准曲线， 对筛选 出感染SCSMV的甘 蔗植株进行荧光定量PCR检测， 通过构建的标准 曲线， 精准测定不同甘蔗种质甘蔗叶片单位体积 SCSMV积累量， 形 成对不同甘蔗种质对SCSMV的抗 感差异精 准比较分析。 本发明方法能精准定量分 析不同甘蔗种质病毒量含量差异， 对感染SCSMV 的甘蔗种质资源进行抗病性精 准评价， 为甘蔗抗 病种质挖掘及通过关联分析挖掘甘蔗内源抗花 叶病基因奠定 基础。 权利要求书2页 说明书9页 附图6页 CN 115449564 A 2022.12.09 CN 115449564 A 1.一种甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)筛选感染单一SCSMV株系甘蔗材 料； (2)待评价甘蔗种质无毒植株制备： 截取待评价的甘蔗种质植株顶端生长点处的幼叶 组织为外植体， 消毒后， 通过愈伤 诱导及脱分化培养获得 组培苗， 室温练苗后， 温室培养， 选 取长势较一 致的植株， 通过病毒检测最终 获得长势一 致的甘蔗 种质无毒幼嫩植株； (3)SCSMV病原液制备： 从 感染单一SCSMV株系甘蔗材 料中提取获得SCSMV病原液； (4)甘蔗种质无毒植株SCSMV病 原接种： 将等量SCSMV病原液分别接种至步骤(2)获得的 无毒幼嫩植株上； (5)筛选出感染SCSMV的甘蔗植株； (6)SCSMV荧 光定量PCR标准曲线构建 对含SCSMV病毒的cDNA模板进行扩增， 将PCR产物克隆至pMD19 ‑T载体， 转化DH5α 感受态 细胞， 构建重组质粒pMD19T ‑SCSMV。 提取pMD 19T‑SCSMV质粒， 测定浓度并计算其拷贝数； 将 梯度稀释的重组质粒标准品作为模板， 进 行实时荧光定量P CR反应， 通过质粒模板不同浓度 梯度的扩增曲线， 得到扩增CT值与单位体积 样品的病毒载量线性关系的标准曲线； (7)不同甘蔗 种质SCSMV定量检测 采集步骤(5)筛选出感染SCSMV的甘蔗植株叶片组织， 分别提取总RNA， 逆转录为cDNA， 并以cDNA为模板进行实时荧光定量P CR检测， 并通过构建的标准曲线， 精 准测定不同甘蔗种 质甘蔗叶片单位体积SCSMV积累量， 形成对不同甘蔗种质对SCSMV的抗感差异精准比较分 析。 2.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病 毒的精准评价方法， 其特征在于， 荧光定量 PCR所用引物对为： SCSMV ‑qF： CTCACGC CAAAGTAAGTCAA和SCSMV ‑qR： TGCTGT TCGAGTTACGATTC。 3.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病 毒的精准评价方法， 其特征在于， 标准曲线 方程为y＝ ‑3.392×LOG(x)+40.19， 其中， y为荧光定量PCR扩增的CT值， 代表PCR扩增的循环 数， 单位cycles， LO G(x)为以10为底x的对数， x为质粒的拷贝数， 单位copies。 4.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法， 其特征在于， 步骤(1) 为： 采集花叶病症状明显的甘蔗植株叶片， 提取叶片总RNA， 通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、 高粱 花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定， 筛选出只 感染SCSMV的甘蔗植株； 优选地， 还对只感染SCSMV的甘蔗植株PCR检测产物进行高通量测 序， 确保无不同SCSMV株系混合 感染的情况； 进一步优选地， 用防虫网保护只感染SCSMV的甘 蔗植株。 5.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法， 其特征在于， 步骤(2) 中通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、 高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性 检测引物进行检测鉴定最终 获得长势一 致的甘蔗 种质无毒幼嫩植株。 6.根据权利要求1所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法， 其特征在于， 步骤(4) 接种时采取对甘蔗最靠近芯叶能看见肥厚带 的叶片进行多个位点的擦伤接种； 优选地， 在 病原液中加入等量石英砂， 拇指和食指蘸取病原液， 搓揉植株最靠近芯叶能看见肥厚带 的 叶片基部至表皮擦伤， 接种完后覆膜或套塑料袋保湿； 进一步优选地， 间隔7天左右对新长 出的完整的最靠 近芯叶能看见 肥厚带的叶片进行擦伤接种， 接种2 ‑4次。 7.根据权利要求1 ‑6中任意一项所述的甘蔗抗条纹花叶病毒的精准评价方法， 其特征权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115449564 A 2在于， 包括以下步骤： (1)筛选感染单一SCSMV株系甘蔗材 料 采集花叶病症状明显的甘蔗植株叶片， 提取叶片总RNA， 通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、 高 粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定， 筛选出 只感染SCSMV的甘蔗植株； 优选地， 还对只感染SCSMV的甘蔗植株PCR检测产 物进行高通量测 序， 确保无不同SCSMV株系混合 感染的情况； 进一步优选地， 用防虫网保护只感染SCSMV的甘 蔗植株； (2)待评价甘蔗 种质无毒植株制备 截取待评价的甘蔗种质植株顶端生长点处的幼叶组织为外植体， 经酒精及升汞消毒、 无菌水冲洗后， 通过愈伤诱导及脱分化培养获得组培苗； 将不同甘蔗种质组培苗室温练苗 后移栽入花盆并转移至温室进 行培养； 温室培养一个月后， 选取长势较一致的植株， 通过甘 蔗花叶病毒(SCMV)、 高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物 进行检测鉴定， 最终 获得长势一 致的甘蔗 种质无毒幼嫩植株； (3)SCSMV病原液制备 采集感染单一SCSMV病原植株的幼嫩叶片， 剪碎放入烧杯， 并以重量与体积比1： 3的比 例加入磷酸缓冲液， 通过匀浆机打磨成泛白的匀浆， 通过纱网过 滤并通过澄清获得病原液； (4)甘蔗种质无毒植株SCSMV病原接种 采用一份甘蔗病原液对应一份甘蔗种质进行接种； 在病原液中加入等量石英砂(优选 为500‑600目)， 上下颠倒混匀， 拇指和 食指蘸取病原液， 搓揉植株+1叶片基部至表皮擦伤， 接种完后覆膜或套塑料袋保湿； 间隔7天左右对新长出的完整的+1叶进 行擦伤接种， 总计重 复接种三次； (5)不同甘蔗 种质感病植株 检测 接种SCSMV病原2个月后， 采集甘蔗植株最靠近芯叶能看见肥厚带的叶片组织， Trizol 法提取叶片总RNA， 通过SCSMV的特异性检测引物进行检测鉴定， 筛选出感染SCSMV的甘蔗植 株； (6)SCSMV荧 光定量PCR标准曲线构建 对含SCSMV病毒的cDNA模板进行扩增， 将PCR产物克隆至pMD19 ‑T载体， 转化DH5α 感受态 细胞， 构建重组质粒pMD19T ‑SCSMV； 提取pMD 19T‑SCSMV质粒， 测定浓度并计算其拷贝数； 将 10倍倍比稀释的重组质粒标准品作为模板， 进行实时荧光定量PCR反应， 反应结束后由系统 自动生成标准曲线， 得到荧 光强度与单位体积 样品的病毒载量的标准曲线； (7)不同甘蔗 种质SCSMV定量检测 分别采集步骤(5)筛选出感染SCSMV的甘蔗植株叶片组织， 提取总RNA， 逆转录为cDNA， 并以cDNA为模板进行实时荧光定量P CR检测， 并通过构建的标准曲线， 精 准测定不同甘蔗种 质甘蔗叶片单位体积SCSMV积累量， 形成对不同甘蔗种质对SCSMV的抗感差异精准比较分 析。 8.一种引物对， 其特征在于， 所述引物对为： SCSMV ‑qF： CTCACGCCAAAGTAAGTCAA和 SCSMV‑qR： TGCTGT TCGAGTTACGATTC。 9.一种如权利要求8所述的引物对在筛选甘蔗抗SCSMV品种、 和/或精准评价甘蔗抗条 纹花叶病毒能力中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115449564 A 3