(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211092299.9 (22)申请日 2022.09.06 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 张衍　刘和　邱旭阳　郑志永　 (74)专利代理 机构 无锡承果知识产权代理有限 公司 32373 专利代理师 肖昂 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基 因相对丰度分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种环 境样品I型整合子携带 抗生素抗性基因相对丰度分析方法， 首先对样品 DNA的I型整合子进行PCR扩增， 对I型整合子的 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化， 而后以该切胶纯化产物为模板进行定量PCR的分 析， 从而对I型整合子携带的抗生素抗性基因进 行检测， 并进行基因在I型整合子上相对丰度的 分析与比较， 从而掌握抗生素抗性基因在I型整 合子上的相对丰度特征。 以PCR为基础， 避免了使 用宏基因组测序分析难度大、 数据挖潜困难、 定 量分析程度不足的问题； 本发明为环境样品I型 整合子抗生素抗性基因的相对丰度分析， 提供了 新的技术方法和研究方向。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 115404269 A 2022.11.29 CN 115404269 A 1.一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： (1)提取样品的DNA； (2)所述DNA的I型整合子进行PCR扩增， 得I型整合子扩增产物； (3)所述I型整合子扩增产物进行 纯化回收， 得 纯化回收产物； (4)以所述纯化回收产物为模板进行定量PCR定量检测； (5)根据定量PCR的定量检测结果， 计算 I型整合子在整合子上的相对丰度。 2.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述PCR扩增的反应体系包含2 ×TransStart  FastPfu PCR SuperMix( ‑dye)12.5μL， 上下游引物各1μL， DNA模板1μL， ddH2O 9.5 μL。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述上下游引物包括： 上游引物 GGCATCCAAGCAGCAAG， 下游引物 AAGCAGACT TGACCTGA。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的温度程序为95℃10min； 35 ×(94℃30s， 55℃30s， 72℃2mi n30s)， 72℃10mi n。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述纯化回收的方法包括： 所 述I型整合子扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后， 再进行切胶纯化。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述琼脂糖凝胶电泳的方法包括： 1体积当 量的质量体积分数为1％ ‑1.5％的琼脂糖凝胶完全融化， 冷却但未凝固前加入0.0001体积 当量的SYBR  Safe DNA Gel Stain， 摇匀后倒入制胶板， 待凝固后放入电泳槽中， 将所述I型 整合子扩增产物 依次加入至 凝胶孔内， 在15 0V条件下 跑胶30min； 所述切胶 纯化的方法包括： 使用产物切胶回收试剂盒将整合子条带从200bp ‑4500bp的 位置切胶回收并纯化。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述定量PCR定量检测的体系 包括： 1×PowerUp SYBR Green Master Mix， 1mg/mL牛 血清白蛋白， 500nM目标抗 性基因前引物， 500nM目标抗 性基因后引物， 10‑20ng/L DNA模板， 所述DNA模板为所述 I型整合子扩增产物的纯化回收产物。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述定量PCR定量检测的反应程序为： 预热 95℃， 10mi n； 变性95℃， 3 0s； 退火6 0℃， 30s； 延伸72℃， 40s； 共40个 循环。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(5)中， 所述I型整合子的相对丰度的 计算方法包括： 抗生素抗性基因定量P CR测试单位体积 拷贝数/单位体积I型整合子浓度， 单 位为copies/ng  I型整合子 。 10.根据权利要求1 ‑9任一所述的方法， 应用于抗 生素抗性基因检测领域。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115404269 A 2一种环境样品I型整合子携 带抗生素抗性基因相对丰 度分析 方法 技术领域 [0001]本发明属于抗生素抗性基因检测技术领域， 具体涉及一种环境样品I型整合子携 带抗生素抗性基因相对丰度分析 方法。 背景技术 [0002]环境微生物抗生素抗性的发展严重威胁人类健康， 引起了人们极大的关注。 I型整 合子是携带抗生素抗性基因的重要遗传元件， 也是引发多重抗生素抗性的重要原因， 使用 便捷的方法分析环境样品I型整合子携带 的抗生素抗性基因特征十分必要。 但目前缺 乏方 便快捷的I型整合子携带抗 生素抗性基因的分析 方法。 [0003]对基因定量常使用定量PCR， 但单纯采用对抗生素抗性基因的定量PCR， 难以区分 是整合子还是在其他DNA片段上携带的抗性基因。 而单纯采用对整合子的PCR， 又仅能对该 样品是否存在 整合子进行定性分析。 如中国专利ZL201010140309.2一种细菌I型、 II型、 III 型整合子基因的PCR检测方法， 公开了一种细菌I型、 II型、 III型整合子基因的PCR检测方 法， 采用I型、 II型、 III型整合 酶基因的引物对对细菌是否含有I型、 II型、 III型整合子进行 检测， 该方法仅能进行是否存在整合子的初步定性判断， 并不能对整合子是否含有目标抗 生素抗性基因(ARG s)以及目标ARG s的丰度进行有效的定性和定量检测。 [0004]采用宏基因组分析的手段， 可以在宏基因组数据中挖掘整合子所携带抗性基因的 信息， 但技术难度大， 分析过程复杂， 数据出现分析错误的概率较高， 定量分析程度低， 分析 周期长， 难以广泛应用。 [0005]通过传统的克隆文库方法进行整合子基因和 序列的分析， 又由于克隆文库整体分 析通量较低， 对于整合子的解析深度不够， 其携带的抗生素抗性基因分析不够全面， 也无法 获得定量的数据。 [0006]因此， 对于整合子携带抗生素抗性基因(ARGs)的定量检测方法是本领域的重点研 究方向， 具有重要的前 景意义。 发明内容 [0007]发明目的： 为了克服现有技术中存在的不足， 本发明提供一种环境样品I型整合子 携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法， 掌握抗生素抗性基因在I型整合子上 的相对丰度 特征。 [0008]技术方案： 为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案为： [0009]本发明的第一个目的是， 提供一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对 丰度分析 方法， 包括以下步骤： [0010](1)提取样品的DNA； [0011](2)所述DNA的I型整合子进行PCR扩增， 得I型整合子扩增产物； [0012](3)所述I型整合子扩增产物进行 纯化回收， 得 纯化回收产物；说　明　书 1/8 页 3 CN 115404269 A 3