(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210695146.7 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 甘肃省畜牧兽医研究所 地址 744000 甘肃省平凉 市崆峒东路143号 (72)发明人 赵子惠　成伟伟　周勇　陈伯祥　 杨明　崔光亚　苟想珍　李元新　 丁姝元　周瑶　吴军斌　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 陆惠中　王永伟 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01)C12N 15/11(2006.01) A61K 39/15(2006.01) A61K 38/21(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种猪轮状病毒重组蛋白及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种重组猪轮状病毒蛋白， 通 过将猪γ干扰素以及猪轮状病毒基因的优势片 段通过连接子融合后， 构建成功原核表达载体， 并进一步诱导制备获得了重组猪γ干扰素 ‑猪轮 状病毒VP7蛋白。 通过将纯化的重组蛋白肌肉免 疫妊娠母猪， 并在产后的母猪中检测到较高含量 的抗PoRV  IgA， 证明制备重组的蛋白具有较高的 免疫原性。 通过对产后仔猪的攻毒实验证明， 免 疫重组猪γ干扰素 ‑猪轮状病毒VP7蛋白的母猪 产下的乳猪对于轮状病毒具有更高的免疫保护 作用。 因此， 将重组猪γ干扰素 ‑猪轮状病毒VP7 蛋白作为制备免疫试剂， 在防治母猪以及仔猪的 病毒性腹泻和死亡方面具有较高的意义， 值得推 广应用。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图2页 CN 114957489 A 2022.08.30 CN 114957489 A 1.一种重组猪 轮状病毒蛋白， 其特 征在于， 所述蛋白的序列如SEQ  ID NO:4所示。 2.一种核苷酸分子， 其特 征在于， 所述核苷酸分子编码权利要求1所述的蛋白。 3.根据权利要求2所述的核苷酸分子， 其特征在于， 所述核苷酸分子的序列如SEQ  ID  NO:3所示。 4.一种表达载体， 其特征在于， 所述表达载体含有权利要求2 ‑3任一所述的核苷酸分 子。 5.根据权利要求 4所述的表达载体， 其特 征在于， 所述表达载体为原核表达载体。 6.重组菌， 其特 征在于， 所述重组菌包 含权利要求 4或5所述的表达载体。 7.根据权利要求6所述的重组菌， 其特 征在于， 所述重组菌为大肠杆菌 。 8.引物对， 包括上游引物和下游引物， 其特征在于， 所述引物对扩增权利要求2或3所述 的核苷酸分子 。 9.根据权利要求8所述的引物对， 其特征在于， 所述引物对的上游引物序列如SEQ  ID  NO:5所示， 所述引物对的下游引物序列如SEQ  ID NO:6所示。 10.权利要求1所述的蛋白， 权利要求2 ‑3所述的核苷酸分子， 权利要求4 ‑5所述的表达 载体在制备猪 轮状病毒免疫试剂中的应用。 11.一种猪轮状病 毒免疫试剂， 其特征在于， 包括权利要求1所述的蛋白和/或权利要求 2‑3所述的核苷酸分子和/或权利要求 4‑5所述的表达载体。 12.根据权利要求1 1所述的免疫试剂， 其特 征在于， 还 包括佐剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114957489 A 2一种猪轮状病毒重组蛋白及其应用 技术领域 [0001]本发明属于重组蛋白疫苗领域， 具体涉及 一种猪轮状病毒重组蛋白及该重组蛋白 的应用。 背景技术 [0002]猪腹泻是一种常见的猪肠道疾病， 致病机理复杂， 可由细菌、 病毒感染， 也可以通 过寄生虫等感染引起， 其中猪病毒性腹泻因其感染速度快、 而且范围广， 危害尤为严重。 引 起猪病毒性腹泻的病毒种类较多， 其中猪流行性腹泻病毒(Porcine  epidemic  diarrhea   virus， PEDV)、 猪轮状病毒(Porcine  rotarvirus  PoRV)、 猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissible  gastroenteritis  virusof swine， TGEV)是引起猪病毒性腹泻的主要病 原， 其均属于RNA病毒。 发病哺乳母猪腹泻， 食欲减退， 无乳， 病仔猪表现为精神沉郁， 食欲 下 降， 排灰白色水样稀便， 同时出现呕吐， 严重者食欲废绝， 皮肤干燥， 失去弹性， 极度消瘦， 并 脱水死亡。 自2010年以来， 我国猪病毒性腹泻的发病率呈明显上升的趋势。 [0003]PoRV为呼肠弧病毒科， 轮状病毒属， 粒子呈球状， 无囊膜， 有双层衣壳， 直径大小为 60‑75nm。 PoRV粒子由外层衣壳(VP4和VP7)、 中层衣壳(VP6)和内衣壳(VP1、 VP2和VP3)构成， 中间层衣壳(VP6)有32个呈放射状排列的圆柱形壳粒组成， 壳粒由此向外呈辐射状排列， 外 衣壳厚约20nm， 为连接于壳粒末端的光滑薄膜状结构， 使 该病毒形成车轮状外观， 轮状病毒 为此而得名。 PoRV由11个分节段dsRNA组成， 全长约为18Kb， 11个片段平均长度约为660 ‑ 3300bp， 经SDS－PAGE分析， 每个节段含有一个顺反子、 分别编码一种蛋白。 基因组分别含有 6个结构蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4、 VP6和VP7和5个非结构蛋白Nsp1、 Nsp2、 Nsp3、 Nsp4和Nsp5 。 [0004]猪轮状病毒外衣壳蛋白主要由VP8与VP7组成， VP8与VP7是猪轮状病毒外膜 上的主 要中和抗原， 能够刺激机体产生体液免疫和黏膜免疫， 从而激发机体的免疫保护作用， 因此 具有以VP 8与VP7为基础研制抗猪 轮状病毒疫苗的潜力。 [0005]猪轮状病毒(Porcinerot avirus， PoRV)是一种常见的引起猪病毒性腹泻的病原， 该病原感染后主要表现为消 化道障碍， 临床特征为腹泻、 脱水、 厌食以及体重减轻。 轮状病 毒可以单独感染引起腹泻、 但 通常与冠状病毒混合感染。 有时也和大肠杆菌共同感染。 轮状 病毒对外界抵抗力强， 病毒在18－20℃可长存7 ‑9个月， 在PH3 ‑9的溶液中可以长期存活。 PoRV可感染各种日龄的猪， 感染率可高达80％ ‑90％， 1周龄仔猪尤为易感。 PoRV感染发病 急、 传播速度快， 范围广， 其发病在时间上 呈周期性， 多发生于 春天和冬 天寒冷季节。 [0006]干扰素(inter feron， IFN)是一类具有广谱抗病毒、 抗细菌、 抗肿瘤和免疫调节等 多种作用的糖蛋白， 具有明显的种属特异性。 按照国际标准可将干扰素分为 Ⅰ(IFN－α、 IFN－β )、 Ⅱ(IFN－γ)和 Ⅲ(IFN－λ )3类， 其中以α －干扰素的抗病毒作用最强。 利用重组猪 α －干扰素治疗猪流行性腹泻(口服， 3mL/(头 ·次)， 2次/d， 连用2～3d)， 仔猪存活率为50％ ～70％， 但在不同猪场使用效果差异较大(存活率37.5％～70.0％不等)， 可能与初生仔猪 感染程度不同有关。 对于严重病例疗效不佳， 原因可能是仅用重组猪α －干扰素不能缓解脱 水和酸中毒症状， 总体来说用于预防的效果， 但防治成本较高。 研究显示利用重组猪α －干说　明　书 1/9 页 3 CN 114957489 A 3