(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210602995.3 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 青岛基迪泰生物科技有限公司 地址 266111 山东省青岛市高新区河东路 368号青岛蓝 色生物医药产业园6号楼 3层305C室 (72)发明人 陈娇　刘森　井豪　唐雪娇　 (74)专利代理 机构 北京正理专利代理有限公司 11257 专利代理师 赵晓丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种犬瘟病毒的可视化恒温快速检测试剂 盒及其应用 (57)摘要 本发明公开一种犬瘟病毒的可视化恒温快 速检测试剂盒及其应用。 本发明首先公开了检测 犬瘟病毒的LAMP引物组及包含该引物组的反应 体系、 冻干体系和可视化恒温快速检测试剂盒。 本发明进一步公开了上述LAMP引物组、 反应体 系、 冻干体系和试剂盒在犬瘟病毒检测中的应 用。 本发明犬瘟病毒的可视化恒温快速检测试剂 盒对设备要求低， 不需要大型仪器设备， 无需精 密的检测设备， 结果可以通过肉眼判定； 操作简 单， 不需要复杂的配液流程， 只需加入核酸样本， 判读原则简单， 只需要看颜色变化， 不需要算法 计算， 无需复杂的培训或专业技术人员； 可常温 保存和运输； 检测时间短； 显色效果好； 检测过程 中全程封闭状态， 避免了气溶胶的污染， 可广泛 应用。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图4页 CN 115074462 A 2022.09.20 CN 115074462 A 1.一种检测犬瘟病毒的LAMP引 物组， 其特征在于， 所述LAMP引 物组包括引 物QW‑1‑F3、 引物QW‑1‑B3、 引物QW ‑1‑FIP、 引物QW ‑1‑BIP、 引物QW ‑1‑LF和引物QW ‑1‑LB， 其中， 所述引物 QW‑1‑F3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述引物QW ‑1‑B3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2 所示， 所述引物QW ‑1‑FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述引物QW ‑1‑BIP的核苷酸序 列如SEQ ID NO.4所示， 所述引物QW ‑1‑LF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 所述引物QW ‑ 1‑LB的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示。 2.一种检测犬瘟病毒的反应体系， 其特征在于， 所述反应体系包括权利要求1所述的 LAMP引物组。 3.根据权利要求2所述的反应体系， 其特征在于， 所述反应体系还包括Buffer、 dNTPs、 LAMP增强剂、 酸碱指示剂和酶混液； 优选的， 所述Buffer 包括Tris ‑HCl、 (NH4)2SO4、 MgSO4、 KCl、 酸碱指示剂、 Triton  X‑100和 甜菜碱； 更优选的， 所述LAMP增 强剂为牛血清白蛋白、 氯化四甲基铵、 单链结合蛋白、 二甲基亚 砜的一种或多种组合； 所述 酸碱指示剂为 酚红、 中性红、 钙黄绿素或溴百 里酚蓝； 最优选的， 所述酶混液为Bst  DNA聚合酶和AMV反转录酶。 4.根据权利要求3所述的反应体系， 其特征在于， 所述反应体系由如下浓度的各组分组 成： 10‑50mM Tris‑HCl、 10‑20mM(NH4)2SO4、 5‑10mM MgSO4、 5‑20mM KCl、 20‑100μM酚红、 1 ‑ 2mM dNTPs、 0.1 ‑0.2％Triton  X‑100、 0.5‑1M甜菜碱、 0.1 ‑0.3 μM引物QW ‑1‑F3、 0.1‑0.3 μM引 物QW‑1‑B3、 0.5‑2 μM引物QW ‑1‑FIP、 0.5‑2 μM引物QW ‑1‑BIP、 0.3‑0.8 μM引物QW ‑1‑LF、 0.3‑ 0.8 μM引物QW ‑1‑LB、 2‑10mM二甲基亚砜、 0.25 ‑1U/ μL Bst DNA聚合酶、 1 ‑5U/ μL AMV反转录 酶和余量的水； 优选的， 所述反应体系由如下浓度的各组分组成： 20mM  Tris‑HCl、 10mM(NH4)2SO4、 6mM  MgSO4、 10mM KCl、 50 μM酚红、 1.6 mM dNTPs、 0.1％Tr iton X‑100、 0.5M甜菜碱、 0.2 μM引物QW ‑ 1‑F3、 0.2 μM引物QW ‑1‑B3、 1μM引物QW ‑1‑FIP、 1μM引物QW ‑1‑BIP、 0.5 μM引物QW ‑1‑LF、 0.5 μM 引物QW‑1‑LB、 5mM二甲基亚砜、 0.4U/μL  Bst DNA聚合酶、 2.5U/μL  AMV反转录酶和余量的 水。 5.一种检测犬瘟病毒的冻干体系， 其特征在于， 所述冻干体系是将权利要求2 ‑4任一所 述的反应体系和冻干保护剂混合后得到的冻干前体系冻干所得； 其中， 所述冻干保护剂包 括海藻糖、 葡聚糖和甘露醇； 优选的， 所述冻干前体系中冻干保护剂的各组分的浓度 为： 海藻糖0.02 ‑0.1g/mL、 葡聚 糖0.01‑0.05g/mL、 甘露醇0.0 5‑0.1g/mL； 更优选的， 所述冻干前体系中冻干保护剂的各组分的浓度为： 海藻糖0.05g/mL、 葡聚糖 0.03g/mL、 甘露醇0.0 5g/mL。 6.根据权利要求5所述的冻干体系， 其特 征在于， 所述冻干包括如下步骤： 预冻阶段： ‑35～‑30℃预冻2 ～4h； 主干燥阶段： 真空度0.01～0.1mbar， 温度 ‑30℃保持2 ～5h； 解析干燥阶段： 真空度0.01～0.1mbar， 温度3 0℃保持2 ～8h。 7.一种犬瘟病毒的可视化恒温快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述可视化恒温快速检 测试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物组或权利要求2 ‑4任一所述的反应体系或权利要权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115074462 A 2求5或6所述的冻干体系。 8.根据权利要求7所述的可视化恒温快速检测试剂 盒， 其特征在于， 所述可视化恒温快 速检测试剂盒还包括裂解液， 所述裂解液包括异硫氰酸胍、 NaCl、 Tris ‑HCl、 EDTA和表面活 性剂； 优选的， 所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、 十四烷基三甲基草酸铵的一种或两种组 合； 更优选的， 所述裂解液由如下浓度的各组分组成： 0.1 ‑0.5M异硫氰酸胍、 0.1 ‑0.8M  NaCl、 20‑100mM Tris‑HCl、 1‑5mM EDTA、 1‑20mM十二烷基硫酸钠和余 量的水； 最优选的， 所述裂解液由如下浓度 的各组分组成： 0.1M异硫氰酸胍、 0.5M  NaCl、 50mM   Tris‑HCl、 2mM EDTA、 10mM 十二烷基硫酸钠和余 量的水。 9.权利要求1所述的LAMP引物组、 权利要求2 ‑4任一所述的反应体系、 权利要求5或6所 述的冻干体系或权利要求7或8所述的可视化恒温快速检测试剂盒在检测犬瘟病毒中的应 用。 10.权利要求7或8所述的可视化恒温快速检测试剂 盒的使用方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： 取待测样本加入裂解液中， 充分 混合后加入冻干体系， 于 63℃反应3 0～60min； 反应结束后进行结果判读： 液体变为黄色， 即结果为阳性， 待测样本中含犬瘟病毒； 液 体变为红色， 即结果 为阴性， 待测样本中不含有 犬瘟病毒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115074462 A 3