(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210623521.7 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 秦启伟　张欣悦　王劭雯　刘嘉昕　 王立群　黄友华　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12N 15/115(2010.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/543(2006.01) C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种特异 性识别新型冠状病毒N蛋白的核酸 适配体及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种特异性识别新型冠状病 毒N蛋白的核酸适配体及其应用。 本发明通过筛 选得到了 可特异性识别新型冠状病毒N蛋白的核 酸适配体apt1和ap t2， 所述核 酸适配体不仅可以 特异性识别新型冠状病毒N蛋白， 且对新型冠状 病毒N蛋白的亲和力高， 可用于检测新型冠状病 毒或制备检测新型冠状病毒的产品。 在所述核酸 适配体apt1和apt2的基础上， 本发明还 提供了一 种用于检测新型冠状病毒N蛋白的胶体金核酸适 配体试纸条、 试剂盒和非疾病诊断目的的检测新 型冠状病毒的方法， 可以快速、 简便、 准确地检测 新型冠状病毒， 无需昂贵的实验仪器， 适用于更 多检测场景。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图4页 CN 115058428 A 2022.09.16 CN 115058428 A 1.一种特异性识别新型冠状病毒N蛋白的核酸适配体， 其特征在于， 包括核酸适配体 apt1和核酸适配体apt2， 核酸适配体apt1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 核酸适配体 apt2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.权利要求1所述核酸适配体在制备新型冠状病 毒检测产品或新型冠状病毒药物载体 中的应用。 3.一种用于检测新型冠状病 毒N蛋白的胶体金核酸适配体试纸条， 其特征在于， 包括依 次搭接于底板上的样品垫、 结合垫、 硝酸纤维素膜和吸水垫； 所述结合垫上包被有胶体金标 记的核酸适配体探针apt1 ‑A， 其核苷 酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述硝酸纤维素膜上设置 有检测线和质控线， 所述检测线上包被有核酸适配体apt ‑T捕获探针， 其核苷酸序列如SEQ   ID NO.4所示； 所述质控线上包被有质控探针apt ‑C， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示。 4.根据权利 要求3所述试纸条， 其特征在于， 所述核酸适配体探针apt 1‑A的5’端被磷酸 化、 巯基化、 甲基化、 氨基化或同位素化。 5.一种非疾病诊断目的 的检测新型 冠状病毒的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.孵育： 将捕获适配体APT2和扩增适配体APT1与待测样品一起孵育得到孵育混合液； 所述捕获适配体APT2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 其3 ’端修饰有生物素； 所述扩增适 配体APT1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； S2.链置换扩增反应： 在步骤S1所得孵育混合液中加入链霉亲和素修饰的磁珠， 振荡反 应得到捕获适配体 ‑目标蛋白 ‑扩增适配体 ‑磁珠复合物， 再利用所得捕获适配体 ‑目标蛋 白‑扩增适配 体‑磁珠复合物与S DA引物进行链置换扩增反应； S3.检测： 将步骤S2链置换扩增反应所得产物滴加在权利 要求3所述胶体金核酸适配体 试纸条的样品垫上， 观察显色结果； S4.判断结果： 若胶体金核酸适配体试纸条上的检测线和质控线都显示为红色时， 检测 结果为阳性； 当检测线不显 色， 质控线显示为红色时， 检测结果为阴性； 当质控线不显 色时， 无论检测线显不显示红色， 检测结果都判断为无效。 6.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S1中所用捕获适配体和扩增适配体的使 用浓度为180～ 220nM， 孵育温度为 4℃， 孵育时间为20～40mi n。 7.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S2所述链置换扩增反应中所用SDA引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示。 8.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S2所述链置换扩增反应的反应体系为超 纯水12.5 μL、 SDA引物2 μL、 buffer  2 μL、 dNTPs  2 μL、 聚合酶0.8 μL、 切刻内切酶Nt.BbvCI  0.7 μL。 9.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S2所述链置换扩增反应的反应条件为37 ～50℃， 20～3 0min。 10.一种检测新型冠状病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒中含有权利要求3或4所 述用于检测新型冠状病毒N蛋白的胶体金核酸适配体试纸条， SEQ  ID NO.6所示扩增适配体 APT1， SEQ  ID NO.2所示捕获适配体AP T2， SEQ ID NO.7所示SDA引物和链置换扩增反应所需 试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058428 A 2一种特异性识别新型冠状病毒N蛋白的核酸适配体及其应用 技术领域 [0001]本发明属于病毒检测技术领域。 更具体地， 涉及一种特异性识别新型冠状病毒N蛋 白的核酸 适配体及其应用。 背景技术 [0002]新型冠状病毒(SARS ‑CoV‑2)是目前发现的第7种β 属冠状病毒， 具有较高的传染性 和隐蔽性， 对其进 行检测有助于新冠肺炎的预防和治疗， 也便于及时采取措施， 防止病毒传 播扩散。 [0003]目前， 新型冠状病毒的检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、 病毒核酸检测以及 特异性抗体的检测。 病毒分离与鉴定是最传统的检测方法， 但是病毒培养时间长、 技术要求 较高， 只适用于三级安全的生物实验室， 不适合大批量的快速检测。 核酸检测是目前最常规 的新型冠状病毒检测方法， 又可分为高通量测序、 实时荧光定量PCR、 等温扩增技术和抗体 检测。 但高通量测序检测成本较高， 检测时间较长； 荧光定量PCR技术操作繁琐， 对仪器设备 要求较高； 抗体检测则易受到较多因素干扰。 因此， 提供一种无需仪器且操作简 便快捷的检 测新型冠状病毒的产品和方法具有重要意 义。 [0004]胶体金试纸条是病原体检测方法中使用最广泛的一种， 其操作简便、 反应时间短， 但缺陷是灵敏度不够高， 可能存在假阴性。 现有技术中虽有关于检测新型冠状病毒N蛋白的 适配体胶体金试纸条的报道， 但其检测主要依赖的是新型冠状病毒N蛋白单抗， 此类抗体在 极端条件下的稳定性差， 容 易失活， 若保存不当， 用其检测易出现假阴性结果。 发明内容 [0005]本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足， 提供一种特异性识 别新型冠状病毒N蛋白的核酸 适配体及其应用。 [0006]本发明的第一个目的是提供一种特异性识别新型 冠状病毒N蛋白的核酸 适配体。 [0007]本发明的第二个目的是提供所述特异性识别新型冠状病毒N蛋白的核酸适配体在 制备新型 冠状病毒检测产品或新型 冠状病毒药物载体中的应用。 [0008]本发明的第三个目的是提供一种用于检测新型冠状病毒N蛋白的胶体金核酸适配 体试纸条。 [0009]本发明的第四个目的是提供一种非疾病诊断目的 的检测新型 冠状病毒的方法。 [0010]本发明的第五个目的是提供一种检测新型 冠状病毒的试剂盒。 [0011]本发明上述目的通过以下技 术方案实现： [0012]新型冠状病毒(SARS ‑CoV‑2)包含4种结构蛋白， 分别为核衣壳蛋白(N蛋白)、 包膜 蛋白(E蛋白)、 膜蛋白(M蛋白)和刺突蛋白(S蛋白)。 其中， N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕 形成病毒核衣壳， 在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。 同时， N蛋白相 对保守， 在病 毒的结构蛋白中含量非常丰富， 可作为新型冠状病毒的检测标记。 在此基础上， 本发明筛选 得到了一种可特异性识别新型冠状病毒N蛋白的核酸适配体， 包括核酸适配体apt1和核酸说　明　书 1/11 页 3 CN 115058428 A 3