(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210607051.5 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市邗江区大 学南 路88号 (72)发明人 杨辉　张莹莹　季通伟　江逸楠　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 刘艳艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR 引物及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种特异性检测蛭弧菌数量 的绝对定量PCR引物及检测方法， 包括特异性引 物； 检测方法包括： 提取待测样品的DNA； 通过特 异性引物对 提取的待测样品DNA进行PCR扩增； 对 PCR扩增后的产物进行纯化； 将纯化后的DNA与载 体进行连接扩培， 制得重组质粒； 对重组质粒进 行提取， 并进行浓度测定； 将提取的重组质粒进 行倍比稀释， 制得重组质粒标准模板； 将特异性 引物加入到重组质粒标准模板中， 进行荧光定量 PCR检测， 建立CT值与拷贝数之间的转换关系； 将 特异性引物加入到需要检测的样品中， 进行荧光 定量PCR检测， 测定样品的CT 值， 根据CT 值与拷贝 数之间的转换关系， 得出拷贝数。 本发明能够准 确检测出蛭弧菌， 并且检测过程简单易操作。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 114807402 A 2022.07.29 CN 114807402 A 1.一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物， 其特征在于， 包括特异性引物， 所 述特异性引物的序列为： Bd‑F上游引物： CAG GCCTAACACATGCA AGTC； qBd‑F上游引物： GT TTACGGCGTGGACTACC； qBd‑R下游引物： CGWCACTGA AGGGGTCAA。 2.一种根据权利要求1所述的特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 提取待测样品的DNA； 通过特异性引物对提取的待测样品DNA进行PCR扩增； 对PCR扩增后的产物进行 纯化； 将纯化后的DNA与载体进行 连接扩培， 制得重组质粒； 对重组质粒进行提取， 并进行浓度测定； 将提取的重组质粒进行倍比稀释， 制得重组质粒 标准模板； 将特异性引物加入到重组质粒标准模板中， 进行荧光定量PCR检测， 建立CT值与拷贝数 之间的转换关系； 将特异性引物加入到需要检测的样品中， 进行荧光定量PCR检测， 测定样品的CT值， 根 据CT值与拷贝数之间的转换关系， 得 出拷贝数。 3.根据权利要求2所述的一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于： 通过DNA提取 试剂盒提取待测样品的DNA。 4.根据权利要求2所述的一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于： 通过琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增后的产物进行 纯化。 5.根据权利要求2所述的一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于： 载体包括pMD19 ‑T载体。 6.根据权利要求2所述的一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于： 通过质粒小提试剂盒提取重组质粒， 并通过Nanodr op测定重组质粒的浓度， 换 算成数量/体积单位。 7.根据权利要求2所述的一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于： 倍比稀释分别为109、 5×108、 108、 5×107、 107、 5×106、 106、 5×105、 105、 5× 104、 104 copies/mL。 8.根据权利要求2所述的一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于： CT值与拷贝数的转换关系为y= 3E+13e‑0.586x。 9.根据权利要求2所述的一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测方法， 其特征在于， 还 包括： 对PCR扩增后的产物进行引物特异性的验证。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807402 A 2一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于功能陶瓷材料技术领域， 涉及 一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量 PCR引物及检测方法。 背景技术 [0002]细菌性疾病一直给水产养殖业造成巨大的经济损失。 细菌性疾病不仅会造成水产 动物的大量死亡， 还会诱导病毒性疾病的爆发， 导致大规模水产动物疫病， 严重阻遏水产养 殖业的发展。 目前防治细菌性致病菌最常用的方法是抗生素， 但是长期使用抗生素会导致 细菌产生耐药性。 因此抗生素 的有效替代品的研究， 对于水产动物病害防控具有十分重要 的作用。 [0003]在水产养殖业中无抗养殖的理念已经兴起。 相对于传统的养殖过程中使用大量抗 生素造成水环境污染和养殖动物体内抗生素的残留， 无抗养殖更加偏重于使用生物制剂进 行病害的防控。 蛭弧菌 （ Bdellovibr io） 是一类专门寄生于其他细菌并能导致其裂解的革兰 氏阴性菌。 蛭弧菌 （ Bdellovibrio ） 对所攻击的宿主没有特异性， 其裂解普较宽， 它们甚至能 攻击产生 耐药性的致病菌株。 Bdellovibr io具有和噬菌体类似的功能， 但 不是病毒， 而且抑 菌的广谱性比噬菌体更强。 Bdellovibr io能穿透生物膜对深藏在生物膜内的致病菌进行攻 击， 从而高效地控制生物膜内致病菌的繁殖， 这也较好地解决了抗生素对生物膜内致病菌 控制效果差的难题。 [0004]蛭弧菌制剂在现阶段是使用较为广泛的一种生物防控的制剂。 蛭弧菌不但可以裂 解水产养殖中的致病菌， 同时还可以联合其他有益菌通过拮抗等作用来净化水体。 蛭弧菌 可以裂解细菌生物膜， 消除了细菌生物膜对于抗生素 的阻碍作用， 使用生物剂型 的蛭弧菌 制剂来代替抗生素应用在未来成为可能， 但市面上 的蛭弧菌产品良莠不齐。 目前噬菌蛭弧 菌的检测主要为双平板计数噬菌斑， 无法准确分辨蛭弧菌和快速简便统计蛭弧菌培养数 量。 发明内容 [0005]本发明的目的在于克服现有技术中的不足， 提供一种特异性检测蛭弧菌数量的绝 对定量PCR引物及检测方法， 能够准确检测出蛭弧菌， 并且检测过程简单易操作。 [0006]为达到上述目的， 本发明是采用下述 技术方案实现的： 一方面， 本 发明提供了一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物， 包括特异 性引物， 所述特异性引物的序列为： Bd‑F上游引物： CAG GCCTAACACATGCA AGTC； qBd‑F上游引物： GT TTACGGCGTGGACTACC； qBd‑R下游引物： CGWCACTGA AGGGGTCAA。 [0007]另一方面， 本发明提供了一种特异性检测蛭弧菌数量的绝对定量PCR引物的检测 方法， 包括以下步骤：说　明　书 1/5 页 3 CN 114807402 A 3