(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210737514.X (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 深圳市罗湖区人民医院 地址 518000 广东省深圳市罗湖区南湖街 道友谊路47号 (72)发明人 吴松　王珊　王熵　郝同雨　 (74)专利代理 机构 深圳市君胜知识产权代理事 务所(普通 合伙) 44268 专利代理师 谢松　徐凯凯 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种沙门氏菌parC S80I突变的核 酸检测试 剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种沙门氏菌parC  S80I突变 的核酸检测试剂盒及其应用， 其中， 核酸检测试 剂盒包括根据沙门氏菌parC  S80I突变序列设计 的引物对P， 以及由Cas12a蛋白、 crRNA、 缓冲液和 FAM‑TTTTTT‑BHQ探针组成的预混液； 其中， 所述 沙门氏菌par C S80I突变序列为AGC →ATG， 254位 为G>T； 所述引物对P的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1‑2所示， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.3所示。 本发明将PCR技术与基于Cas12a蛋白 的CRISPR结合， 通过设计、 构建、 筛选， 最终提供 一段能靶向Ssp  parC基因S80I(AGC ‑ATC)突变序 列， 并激活LbCas12a系统的crRNA， 利用该靶 点构 建的CRISPR ‑Cas12a系统能够特异性地检测par C 基因S80I突变。 本发明提供的沙门氏菌parC   S80I突变的核酸检测试剂盒具有检测效率高以 及检测灵敏度高的优点。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 115261497 A 2022.11.01 CN 115261497 A 1.一种沙门氏菌parC  S80I突变的核酸检测试剂盒， 其特征在于， 包括根据沙门氏菌 parC S80I突变序列设计的引物对P， 以及由C as12a蛋白、 crRNA、 缓冲液和FAM ‑TTTTTT‑BHQ 探针组成的预混液； 其中， 所述沙门氏菌parC  S80I突变序列为AGC →ATG， 254位为G>T； 所述 引物对P的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑2所示， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所 示。 2.根据权利要求1所述的沙门氏菌parC  S80I突变的核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所 述预混液中， crRNA的浓度大于15 0nM。 3.根据权利要求1所述的门氏菌parC  S80I突变的核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述 缓冲液为10 ×Buffer缓冲液。 4.一种如权利要求1 ‑3任一所述核酸检测试剂 盒的应用， 其特征在于， 将核酸检测试剂 盒用于检测沙门氏菌parC  S80I突变。 5.根据权利要求4所述核酸检测试剂 盒的应用， 其特征在于， 将核酸检测试剂 盒用于检 测沙门氏菌parC  S80I突变包括 步骤： 提供待测沙门氏菌DNA； 根据引物对P对所述待测沙门氏菌DNA进行PCR扩增， 得到扩增产物； 将所述扩增产物加入由Cas12a蛋白、 crRNA、 缓冲液和FAM ‑TTTTTT‑BHQ探针组成的预混 液中， 进行荧 光定量测量； 若检测到荧 光， 则判定待测沙门氏菌发生沙门氏菌parC  S80I突变。 6.根据权利要求5所述核酸检测试剂盒的应用， 其特征在于， 所述PCR扩增具体包括步 骤： 将所述待测沙门氏菌DNA置于PCR扩增体系， 于95℃进行预扩增5min， 所述PCR扩增体系 中包括引物对P； 然后依次按照95℃， 3 0s； 56℃， 30s； 72℃， 15s进行扩增， 共38个 循环； 最后于72℃自动延伸10mi n， 获得扩增产物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261497 A 2一种沙门氏菌pa rC S80I突变的核酸检测试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测技术领域， 特别涉及一种沙门氏菌p arC S80I突变的核酸检 测试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]沙门氏菌属革兰氏阴性杆菌， 是一种常见的食源性致病菌。 沙门氏菌感染是一个 重大的全球公共卫生问题， 已在许多国家引起食源性疾病。 世界各国的细菌性食物中毒中， 沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首， 我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。 [0003]耐多药沙门氏菌的出现是一个主要的全球食品安全问题， 而耐多药沙门氏菌的感 染会增加发病率和死亡率。 其中， 对喹诺酮类药物和氟喹诺酮 类药物的耐药性(特别是对环 丙沙星的耐药性)， 在世界范围内变得越来越重要。 介导氟喹诺酮类药物耐药的主要机制是 喹诺酮类药物耐药决定区  (quinolone resistance‑determining  region， QRDR)突变和质 粒介导的喹诺酮类药物耐药基因(plasmid ‑mediated  quinolone  resistance， PMQR)的存 在。 研究显示， 耐环丙沙星沙门氏菌被发现广泛分布在各种动物源性食品中。 DNA拓扑异构 酶IV基因parC和parE的突变与喹诺酮类药物耐药直接相关。 [0004]传统的药敏检测可以通过抑菌试验， 检测不 同药物的最小抑菌浓度， 或美国国家 临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的纸片扩散法， 通常菌液或菌株划线培养需要16 ‑18小 时。 随着分子生物学 的不断发展， 越来越多的耐药相关基因突变可通过测序等方式进行检 测， 但测序及结果分析也用时较长 。 [0005]因此， 现有技 术还有待于改进和发展。 发明内容 [0006]鉴于上述现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种沙门氏菌p arC S80I突变 的核酸检测试剂盒及其应用， 旨在解决现有沙门氏菌耐药相关基因突变的检测方法检测效 率较低、 灵敏度较差的问题。 [0007]本发明的技 术方案如下： [0008]一种沙门氏菌parC  S80I突变的核酸检测试剂盒， 其中， 包括根据沙门氏菌parC   S80I突变序列设计的引物对P， 以及由Cas12a蛋白、 crRNA、 缓冲液和FA M‑TTTTTT‑BHQ探针组 成的预混液； 其中， 所述沙门氏菌parC S80I突变序列为AGC →ATG， 254位为 G>T； 所述引物对 P的核苷酸序列如  SEQ ID NO.1‑2所示， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 [0009]所述的沙门氏菌parC  S80I突变的核酸检测试剂盒， 其中， 所述预混液中， crRNA的 浓度大于15 0nM。 [0010]所述的门氏菌parC  S80I突变的核酸检测试剂盒， 其特征在 于， 所述缓冲液为10 × Buffer缓冲液。 [0011]一种核酸检测试剂盒的应用， 其中， 将核酸检测试剂盒用于检测沙门氏菌parC   S80I突变。说　明　书 1/7 页 3 CN 115261497 A 3