(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210923056.9 (22)申请日 2022.08.02 (71)申请人 河南省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 450000 河南省郑州市金 水区花园路 116号 (72)发明人 吕世杰　李玉龙　张子敬　王二耀　 楚秋霞　张格阳　冯亚杰　施巧婷　 陈付英　郎丽敏　王红利　 (74)专利代理 机构 郑州明华专利代理事务所 (普通合伙) 41162 专利代理师 袁艳丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测黄牛POLB基因缺失标记的方法 (57)摘要 本发明属于家畜分子遗传学育种技术领域， 具体涉及一种检测黄牛POLB基因缺失标记的方 法。 该方法通过以黄牛基因组DNA为模板， 以特异 性引物对F： 5’ ‑ACTCCAGGTTCCTTTTACTGGC ‑3’， R： 5’ ‑GTCGGTGATGCCCCCGT ‑3’为引物， 通过PCR扩增 黄牛个体CDS区上游基因部分片段， 通过电泳检 测PCR扩增产物； 然后使用限制性内切酶MaeI对 PCR产物直接进行酶切， 对酶切后的产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测， 根据电泳检测结果判定黄牛 个体的基因型。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 115261487 A 2022.11.01 CN 115261487 A 1.一种检测黄牛POLB基因缺失标记的方法， 其特征在于， 以黄牛基因组DNA为模板， 以 特异性引物对为引物， 通过P CR扩增黄牛个体CDS区上游基因部分片段， 通过电泳检测PCR扩 增产物； 然后使用限制性内切酶MaeI对P CR产物直接进行酶切， 对酶切 后的产物进行琼脂糖 凝胶电泳检测， 根据电泳检测结果判定 黄牛个体的基因型； 所述引物对为： F： 5’ ‑ACTCCAGGTTCCTTTTACTGGC‑3’； R： 5’ ‑GTCGGTGATGCCCCCGT‑3’。 2.根据权利要求1所述的检测黄牛POLB基因缺失标记的方法， 其特征在于， PCR扩增的 反应体系为： 2 × Taq PCR Master Mix 5.00 μL， ddH2O 3.00 μL， P ‑F 0.5 μL， P‑R 0.5 μL， DNA 模板1.0Μl。 3.根据权利 要求1所述的检测黄牛P OLB基因缺失标记的方法  ， 其特征在于， PCR扩增的 反应程序为： 94℃预变性5min； 94℃变性15s， 63℃退火15s， 72℃延伸15s， 38个循环； 72℃延 伸10min； 4℃保存。 4.根据权利要求1所述的检测黄牛POLB基因缺失标记的方法， 其特征在于， 酶切反应体 系为： Bfal  0.4 μL， Buf fer 2 μL， PCR产物  2 μL， ddH2O 15.6 μL， 反应温度37℃， 反应时间8h 。 5.根据权利要求1所述的检测黄牛POLB基因缺失标记的方法， 其特征在于， 所述琼脂糖 凝胶电泳采用质量浓度为3％的琼脂糖凝胶。 6.根据权利要求1所述的检测黄牛POLB基因缺失标记的方法， 其特征在于， 野生基因型 表现为93bp和267bp两个条带； 缺失基因型表现为360bp条带； 杂合基因型表现为93bp、 267bp和3 60bp三个条 带。 7.一种黄牛POLB基因缺失多态性的检测试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒包括用于PCR扩 增牛POLB基因NC_037354.1  CDS区上游c. ‑221_‑210del位12bp  缺失突变位点的引物对， 所 述引物对为： F： 5’ ‑ACTCCAGGTTCCTTTTACTGGC‑3’； R： 5’ ‑GTCGGTGATGCCCCCGT‑3’。 8.一种如权利要求1 ‑4任一项所述的检测黄牛POLB基因缺失标记的方法在黄牛分子标 记辅助选择育种方面的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 在由所述引物对扩增的缺失标记位点， 个 体对应的生长优势基因型为野生型。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261487 A 2一种检测黄牛POLB基因缺失标记的方 法 技术领域 [0001]本发明属于家 畜分子遗传学育种技术领域， 具体涉及一种检测黄牛POLB 基因缺失 标记的方法。 背景技术 [0002]随着我国国民生活水平的提高， 人们对牛肉的消费量也逐年提高。 但是我国牛肉 总体供给量小于消费量， 一部分牛肉还需要依赖进口来填补空缺。 为了进一步提高我国肉 牛的生长性能， 提升育种效率， 将分子育种与常规育种技术相结合成为一种重要手段。 而分 子标记辅助选择(molecular  mark‑assist selection， MAS)是分子育种中的一项关键技 术， 可以利用与生长性状相关的分子标记， 从分子水平对 优势等位基因快速、 准确地选择。 [0003]POLB是1971年Weisssbach等首次从牛胸腺中分离出的一种DNA聚合酶。 该基因属 于DNA聚合酶X家族中的一员。 DNA聚合酶的家族成员在DNA 复制、 DNA损 伤修复、 细胞周期调 控中起重要作用。 Zmudzka等在1986年先后从鼠和人中克隆出POLB基因的DNA序列。 POLB蛋 白是真核细胞中最小的DNA多聚酶， 总共编码3 35个氨基酸， 其蛋白分子质量仅为39ku。 [0004]POLB主要功能是通过参与碱基切除修复(Base  Excision  Repair,BER)系统对DNA 损伤进行修复。 DNA损伤在细胞中如不能得到有效修复， 将易导致细胞的衰老、 凋亡和 癌变。 研究发现， 阻断蛋白激酶A(Protein  Kinase A， PKA)和p38分裂原 活化蛋白激酶(p38MAPK) 信号途径， 降低人食 管癌细胞中POLB基因的表达量， 能够导致该细胞生物学特性 发生改变， 抑制细胞增殖、 促进细胞凋亡。 另外， 在小鼠食管癌细胞和人口腔鳞状细胞癌细胞中， 沉默 或降低POLB基因的表达可以调节细胞周期， 导致有丝分裂异常， 促进细胞增殖。 采用RNA干 扰技术抑制乳癌细胞(MCF ‑7)中POLB基因的表达， 结果发现， 细胞的增殖也受到显著抑制。 沈亮研究发现， POLB基因可能通过PI3K/Akt信号通路对MCF ‑7的增殖和迁移进行调控。 朱艳 艳利用甲基苄基亚硝胺(Nnitrosomethylbenzylamine,NMBA)分别诱导POLB基因敲除的小 鼠食管上皮组织， 经mRNA转录组芯片及差异表达基因GO功能富集分析发现， 有33个差异表 达的基因与细胞增殖调控相关， 有27个差异表达的基因与细胞周期调控相关， 其中涉及到 PI3K/Akt、 MAPK ‑ERK等信号通路。 以上报道表明， POLB基因表达量的变化与细胞的增殖、 凋 亡、 周期调控等活动关系密切。 [0005]然而， POLB基因在牛生长性状方面的研究还较少， 尚未 见到基因多态性相关报道。 发明内容 [0006]针对现有技术存在的缺陷和问题， 本 发明提供一种检测黄牛POLB 基因缺失标记的 方法。 [0007]本发明解决其技术问题所采用的方案是： 一种检测黄牛POLB基因缺失标记的方 法， 以黄牛基因组DNA为模板， 以特异性引物对为引物， 通过PCR扩增黄牛个体CDS区上游基 因部分片段， 通过电泳检测PCR扩增产物； 然后使用限制性内切酶MaeI对PCR产物直接进行 酶切， 对酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 根据电泳检测结果判定黄牛个体的基因说　明　书 1/5 页 3 CN 115261487 A 3