(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210611063.5 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 重庆大学 地址 400044 重庆市沙坪坝区正 街174号 (72)发明人 罗阳　袁睿　龙泉鑫　 (74)专利代理 机构 重庆强大凯创专利代理事务 所(普通合伙) 50217 专利代理师 陈雍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测融合基因及其变体的系统以及方 法和应用 (57)摘要 本发明涉及疾病基因检测技术领域， 具体涉 及一种检测 融合基因及其变体的系统以及方法 和应用。 一种检测融合基因及其变体的系统， 包 括识别切割单元和链置换单元； 所述识别切割单 元包括Cas13a  RNA酶、 用于识别融合基因的引导 RNA和触发RNA； 所述链置 换单元包括探针H1和探 针H2。 本技术方案解决了现有 技术中缺少能够简 单快速检测 融合基因及其变体的系统以及方法 的技术问题。 本方案可在1小时内完成肺癌患者 EML4‑ALK融合变异的灵敏可靠 的检测； 在RNA总 量为10ng时， 检测低至0.5％的突变分子， 最低检 测浓度可达10‑4ng/μL， 适用于临床标本的测 定 等， 能成为具有实际临床应用价 值的检测手段。 权利要求书1页 说明书17页 序列表4页 附图4页 CN 114854862 A 2022.08.05 CN 114854862 A 1.一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 包括识别切割单元和链置换单元； 所述识别切割单元包括Cas13a  RNA酶、 用于识别融合基因RNA的引导RNA和触发RNA； 所述链 置换单元包括探针H1和探针H2。 2.根据权利要求1所述的一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 所述识别切 割单元还包括核酸酶 缓冲液； 所述链置换 单元还包括KCl和核酸酶 缓冲液。 3.根据权利要求2所述的一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 所述融合基 因为EMAL‑ALK融合基因。 4.根据权利要求3所述的一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 所述EMAL ‑ ALK融合基因包括变 体V1、 变体V2、 变体V3a、 变 体V3b、 变 体V4、 变体V5a和变 体V5b。 5.根据权利要求4所述的一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 在所述链置 换单元中， 探针H1的序列如SEQ  ID NO.4所示， 探针H1第8位的T上修饰有FAM荧光基团， 3 ’末 端修饰有Dabcyl基团； 探针H2的序列如SEQ  ID NO.5所示。 6.根据权利要求5所述的一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 探针H1的第 34位的G和第35位的A均为肽核酸； 或者探针H1的第25位的C和第26位的C均为肽核酸； 或者 探针H2的第17位的T和第18位的G均为肽 核酸； 或者探针H2的第10位的C和第11位的T均为肽 核酸。 7.根据权利要求6所述的一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 在所述识别 切割单元中， 引导RNA的序列如SEQ  ID NO.1、 SEQ ID NO.6‑SEQ ID NO.11中任意一种所示； 触发RNA的序列如SEQ  ID NO.3所示。 8.根据权利要求7所述的一种检测融合基因及其变体的系统， 其特征在于， 在所述识别 切割单元的运行时间为20 ‑60min， 运行温度为37℃； 引导RNA的工作浓度为100ng/μL、 Cas13a RNA酶的工作浓度为25 ‑125nM、 触发 RNA的工作浓度为10 ‑50nM； 所述链置换单元的运行 时间为10 ‑50min， 运行温度为37℃； 探针H1的工作浓度为75nM、 探针H2的工作浓度为75nM、 KCl的工作浓度为10nM 。 9.根据权利要求1 ‑8中任一项所述的一种检测融合基因及其变体的系统的使用方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1： 将待测样品、 引导RNA、 RNA 酶和触发RNA混合于核酸酶缓冲液中， 获得第一步反应体 系； 37℃反应20 ‑60min， 获得体系 Ⅰ； S2： 在体系 Ⅰ中加入探针H1、 探针H2和KCl， 获得第二步反应体系； 37℃反应10 ‑50min， 获 得体系Ⅱ； S3： 对体系 Ⅱ进行荧光检测， 荧光检测的激发波长为495nm， 检测520nm处的荧光强度 值。 10.根据权利要求1 ‑8中任一项所述的一种检测融合基因及其变体的系统在制备对非 小细胞肺癌进行诊断和分型的系统中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854862 A 2一种检测融合基因及其变体的 系统以及方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及疾病相关基因检测技术领域， 具体涉及一种检测融合基因及其变体的 系统以 及方法和应用。 背景技术 [0002]在现有基因突变检测系统中， 主要分为荧光原位杂交技术(FISH)、 免疫组织化学 (IHC)、 逆转录聚合酶链反应(RT ‑PCR)、 恒温扩增技 术以及测序技 术， 具体如下。 [0003]1.荧光原位杂交技 术(FISH)： [0004]FISH主要原理： 是目前融合基因检测的金标准。 利用报告分子(如生物素、 地高辛 等) 标记核酸探针， 然后将 探针与染色体或DNA纤维切片上的靶DNA杂交， 若两者同源互补， 即 可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。 此时可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素 之间 的免疫化学反应， 经荧 光检测体系在镜下对待DNA进行定性、 定量或相对定位分析。 [0005]缺点： 实验操作负责， 技术要求较高。 对于基因融合产生的EML4 ‑ALK转录变体 或对 其 他ALK融合 伴侣鉴定无法准确表征。 [0006]2.免疫组织 化学(IHC)： [0007]IHC主要原理： 先把组织或细胞中的某种化学物质提取出来， 以此作为抗原或半抗 原， 通过免疫动物后获得特异 性的抗体， 再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物 质。 由 于抗原与抗体的复合物是无色的， 因此还必须借助于组织化学的方法把抗原抗体结 合的部位 显示出来， 以其达 到对组织或细胞中的未知抗原进行定性， 定位或定量的研究。 [0008]缺点： 主要用于鉴定细胞表面融合蛋白的表达， 但在部分样本中ALK蛋白可能不表 达或 表达水平较低， 导 致检测灵敏度低， 对结果判断较主观。 [0009]3.逆转录聚合酶链反应(RT ‑PCR)： [0010]RT‑PCR主要原理： 是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的   技术。 原理是提取组织或细胞中的总RNA或者mRNA， 在反转录酶的作用下将RNA或者mRNA  反 转录成cDNA， 再以该cDNA第一链 为模板进行PCR扩增， 根据靶基因设计用于PCR扩增的  基因 特异的上下游引物， 基因特异的上游引物与cDNA第一链退火， 在Taq  DNA聚合酶作用  下合 成cDNA第二链。 再以cDNA第一链和第二链为模板， 用基因特异的上下游引物PCR扩增  获得 大量的cDNA。 [0011]缺点： 只能检测单个融合基因， 对于基因融合产生的EML4 ‑ALK转录变体或对其他 ALK 融合伴的侣鉴定无法准确表征。 [0012]4.等温扩增技 术： [0013]核酸体外扩增技术， 其反应过程始终维持在恒定 的温度下， 通过添加不 同活性的 酶和各 自特异性引物来达 到快速核酸扩增的目的。 常见的等温扩增技 术有以下几种: [0014]滚环扩增(RCA)： 以环状DNA为模板， 通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互 补)， 在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA， 此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片 段。说　明　书 1/17 页 3 CN 114854862 A 3