(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210686654.9 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 云南省寄生虫病防治所 地址 665000 云南省普洱 市思茅区西园路6 号 (72)发明人 杨亚明　郭建妮　蔡璇　吴方伟　 李奔福　严信留　彭佳　字金荣　 王正青　徐倩　李建雄　 (74)专利代理 机构 广州凯东知识产权代理有限 公司 44259 专利代理师 曾志环 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测美洲钩虫的引物混合物、 试剂盒及 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测美洲钩虫的引物混 合物、 试剂盒及检测方法， 所述引物混合物包括： 引物F3.3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 引 物B3.3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 引物 FIP3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 引物 BIP3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 引物 LF3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 引物 LB3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示， 本发明 还提供一种所述的引物混合物在检测美洲钩虫 的试剂盒中的应用， 美洲钩虫检测体系、 检测方 法。 本发明的优点包括： 扩增时间短、 操作简单、 成本低、 灵敏度高、 特异性 好。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图3页 CN 114807389 A 2022.07.29 CN 114807389 A 1.一种检测美洲钩虫的引物混合物， 其特 征在于： 所述引物混合物包括： 引物F3.3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 引物B3.3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 引物FIP3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 引物BIP3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 引物LF3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 引物LB3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 2.一种如权利要求1所述的引物混合物在制备检测美洲钩虫的试剂盒中的应用。 3.根据权利要求2所述的检测美洲钩虫的试剂盒， 其特 征在于： 包括如下成分： 不含Tris， pH为8.8的反应缓冲液、 所述引物混合物、 dNTP、 甜菜碱、 甲酚红、 Bst ‑DNA酶、 ddH2O。 4.一种应用如权利要求1所述的引物混合物构建的美洲钩虫LAMP扩增体系， 其特征在 于： 所述LAMP扩增体系， 其包括： 不含Tris和pH为8.8的1 ×反应缓冲液、 引物混合物、 终浓 度为1.2mM的dNTP、 终浓度为0.8M的甜菜碱、 终浓度为50 μM甲酚红、 8U的Bst ‑DNA酶、 终浓度 为1 μM模板、 d dH2O； 所述引物混合物包括终浓度为1.6μM的FIP、 终浓度为1.6μM的BIP、 终浓度为0.2μM的 F3、 终浓度为0.2 μM的B3、 终浓度为0.4 μM的LF、 终浓度为0.4 μM的LB。 5.一种非疾病诊断目的应用如权利要求4所述的美洲钩虫检测体系的检测方法， 其特 征在于： 包括步骤如下： (1)从样品中提取 虫卵DNA； (2)采用半巢式PCR对提取的虫卵DNA进行扩增； (3)选取步骤(2)半巢式PCR扩增成功的阳性样本的DNA构建质粒,作为LAMP扩增的模 板， 开启LAMP扩增， LAMP扩增条件是6 5℃反应5 0min， 70℃热盖； (4)判断是否阳性。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特 征在于： 所述步骤(4)的判断标准是以下两种方式的任一种： 1)颜色变化： 阴性无明显颜色变化， 发生阳性扩增后变为黄绿色； 2)琼脂糖凝胶电泳： 扩增结束后， 取7μl扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳， 120V， 30min， 电泳结束后在凝胶成像仪下观看有无典型阶梯状条 带产生。 7.根据权利要求5所述的检测方法， 其特 征在于： 所述样品包括人或动物排泄的粪便样品， 也可用于 土壤样品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807389 A 2一种检测美洲钩虫的引物混合物、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技 术领域， 尤其涉及美洲钩虫检测技 术。 背景技术 [0002]美洲钩虫， 钩口科(Ancylostomatidae)线虫。 钩虫的成虫寄生在人体的小肠， 致人 体长期慢性失血， 引起钩虫病(hookworm  disease)， 患者会出现贫血及与贫血相关的症状。 重症者， 劳动力明显下降， 甚至危害生命安全。 [0003]针对美洲钩虫感染检测， 当前主要还是采用世界卫生组织推荐的改良加藤厚涂片 法， 该法经济方便， 镜下观察到虫卵即可确诊； 其他检测方法还有聚合酶链式反应、 免疫学 等方法。 但是， 这些方法都存在不同程度缺陷， 如耗时长、 灵敏度不高、 操作复杂、 需要昂贵 的仪器设备、 对操作人员要求高， 容易造成漏检， 使其难以在经济落后的基础地区推广应 用， 钩虫病的防治带来 一定的难度。 具体如下： [0004]一、 直接涂片法： 简单易行， 适用于感染率较高的地区， 但对于轻度感染易漏诊。 [0005]二、 改良加藤厚涂片法： 采用定量板 ‑甘油孔雀绿玻璃纸透明计数虫卵的方法， 简 单易行， 能定量检测感染度， 也可用于实验室诊断和流行病学调查。 但对镜检人员镜检技术 要求高， 感染度低时容 易漏检。 [0006]三、 钩蚴培养法： 检出率高， 在光镜下可以观察幼虫形态并鉴别虫种， 但需时较长， 培养5至6天才有结果。 [0007]四、 酶联免疫吸附实验： 把标记的抗原或者抗体与被包于固相载体上的配体结合， 再使之与相应的无色底物作用而显示颜色， 根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值。 缺点就是灵敏度较低。 [0008]五、 pcr技术： 在引物介导下特异性扩增D NA的一种技术。 包括模板D NA热变性解链 ‑ 引物与模板DNA退火 ‑引物延伸3个步骤的循环过程。 其基本原理是在实验条件下， 根据温度 的变化控制DNA 解链和退火， 在引物启动和DNA聚合 酶催化下， 合成二引物特定区域内的DNA 链。 经过20～30个循环反应， 可使引物特定区段内的DNA量增加 至少十万至百万倍。 此方法 较为复杂， 耗时。 发明内容 [0009]本发明的目的在于提供一种检测美洲钩虫的引 物混合物、 试剂盒及检测方法， 以 解决现有技术中耗时长、 灵敏度不高、 操作复杂、 需要昂贵的仪器 设备、 对操作人员要求高， 容易造成漏检等问题。 [0010]为了达到上述目的本发明采用如下技 术方案： [0011]本发明提供一种检测美洲钩虫的引物混合物， 所述引物混合物包括： [0012]引物F3.3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； [0013]引物B3.3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； [0014]引物FIP3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示；说　明　书 1/11 页 3 CN 114807389 A 3