(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210578888.1 (22)申请日 2022.05.26 (71)申请人 大连大学 地址 116622 辽宁省大连市经济技 术开发 区学府大街10号 (72)发明人 张正韬　熊可　曹钧雄　肖安超　 晏彦瑾　康静怡　王凯悦　王钦富　 (74)专利代理 机构 大连智高专利事务所(特殊 普通合伙) 2123 5 专利代理师 宋文君 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一种检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂 盒及其使用方法 (57)摘要 本发明属于微生物检测技术领域， 公开了一 种检测细胞培养物支原 体污染的PCR试剂盒及其 使用方法。 所述试剂盒内设有dH2O、 上游引物冻 干粉、 下游引物冻干粉、 Taq酶、 PCRBuffer， 其中， 所述上下 游 引物序列分 别为 ： For ： 5 ’‑ CCAGCAAGCCGCGGTAATACATAGG ‑3’Rev： 5’ ‑ GTGGACTACYAGGGTATCTAATCC ‑3’上述试剂盒具体 使用方法包括预变性、 变性、 退火、 延伸并循环35 次。 本发明利用支原体PCR检测， 在体外模拟体内 的DNA复制， 通过 温度的变化来控制DNA的复性和 变性， 引物作为启动子， 在Taq酶， dNTP的作用下 可以扩增支原 体特定的核酸序列， 因此可以用于 识别多种支 原体。 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 CN 114752693 A 2022.07.15 CN 114752693 A 1.一种检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂盒， 其特征在于， 盒内设有dH2O、 上游引 物冻干粉、 下游引物冻干粉、 Taq酶、 PCR  Buffer； 其中， 所述上 下游引物序列分别为： For： 5’ ‑CCAGCAAGCCGCGGTAATACATAG G‑3’ Rev： 5’ ‑GTGGACTACYAGGGTATCTAATCC‑3’。 2.根据权利要求1所述的检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂盒， 其特征在于， 所述 PCRBuffer数量为2管/盒。 3.基于权利要求1所述的检测细胞培养物支原体污染的PCR试剂 盒的使用方法， 其特征 在于， 具体步骤为： S1.预变性： 在温度95℃条件进行 预变性， 时间3mi n； S2.变性： 保持 温度不变， 时间为3 0s； S3.退火： 温度降至 55℃， 时间3 0s； S4.延伸： 在72℃条件下维持3 5s； 步骤S1‑S4循环35次， 最后在72℃条件下维持10mi n， 将温度降至4℃保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752693 A 2一种检测细胞培养 物支原体污染的PCR试剂盒及其使用方 法 技术领域 [0001]本发明属于微生物检测技术领域， 具体涉及一种检测细胞培养物支原体污染的 PCR试剂盒及其使用方法。 背景技术 [0002]大多数的支原体以球形为主， 有三层结构的细胞膜具有极大的可变性， 对人类和 动物均具有一定的致病性并且能在无生命的人工培养基上生长繁殖。 支原体的基因组多 数 为双链DNA， 散布于整个细胞中的拟核或者没有形成的核区中。 支原体的细胞膜中含甾醇， 对保持细胞膜的完整性起了很大作用， 革兰氏染色不易着色， 支原体的种种 特性都足以说 明它不易被检测和清除的特点。 [0003]当细胞被支原体污染后， 细胞内的DNA、 RNA及蛋白质的表达均会发生不同程度的 变化， 但细胞生长速率一般并未发生显著影响， 因此通过常规的观察方法一般很难以被察 觉， 而一旦被支原体污染， 对细胞的影响很大， 对于后续的实验操作或工艺生产有巨大危 害， 因此及时确定细胞 是否被支 原体污染是十分必要的。 [0004]目前电子显微镜或称相差显微镜观察法， 即用扫描电镜或透射电镜直接去观察支 原体形态， 经观察可发现呈暗色颗粒状即为支原体。 此方法虽然直接简单， 但 缺点为检测成 本高， 设备昂贵。 发明内容 [0005]为了克服现有技术的不足， 本 发明提供一种检测细胞培养物支原体污染的  PCR试 剂盒及其使用方法， 通过建立PCR检测的方法建立了一种能鉴定支原体污染的PCR方法， 准 确性高、 检测速度快、 价格低廉、 具有实际应用价 值。 [0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的： 一种检测细胞培养物支原体污染 的PCR试剂盒， 盒内设有dH2O、 上游引物冻干粉、 下游引物冻干粉、  Taq酶、 PCRBuf fer。 [0007]其中， 所述上 下游引物序列分别为： [0008]For： 5’ ‑CCAGCAAGCCGCGGTAATACATAG G‑3’ [0009]Rev： 5’ ‑GTGGACTACYAGGGTATCTAATCC‑3’ [0010]进一步的， 所述PCRBuf fer数量为2管/盒。 [0011]上述试剂盒进行PC R扩增可产生分子量为280bp的特异性扩增 产物， 所述试剂盒具 体使用方法为： [0012]1.预变性： 在温度95℃条件进行 预变性， 时间3mi n； [0013]2.变性： 保持 温度不变， 时间为3 0s； [0014]3.退火： 温度降至 55℃， 时间3 0s； [0015]4.延伸： 在72℃条件下维持3 5s； [0016]步骤1‑4循环35次， 最后在72℃条件下维持10mi n， 将温度降至4℃保存。 [0017]本发明与现有技术相比的有益效果是： (1)利用支原体PCR检测， 在体外模拟体内说　明　书 1/3 页 3 CN 114752693 A 3