(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211081697.0 (22)申请日 2022.09.06 (71)申请人 安徽医科 大学 地址 230000 安徽省合肥市梅 山路81号 (72)发明人 杜忆南　宗凯　曹华科　祝亚亭　 李倩　 (74)专利代理 机构 苏州翔远专利代理事务所 (普通合伙) 32251 专利代理师 王华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法及 试剂盒 (57)摘要 一种检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法及 试剂盒， 包括核酸提取得到待检核酸； 以设计的 引物进行扩增反应， 得到核酸扩增产物； 配置 CRISPR反应混合液， 2μL核 酸扩增产物加入到第 一CRISPR反应混合液 或第二CRISPR反应混合液， 37℃孵育30分钟， 通过荧光读取检测结果。 本发 明具有检测速度快、 准确度高、 成本低以及多场 景实时检测的优点。 权利要求书2页 说明书13页 附图4页 CN 115287375 A 2022.11.04 CN 115287375 A 1.一种检测筛查 新冠病毒Y45 3F突变的试剂盒， 其特 征在于： 所述试剂盒包括： 一组RT‑RAA扩增引物： RT‑RAA上游引物： 5’ ‑GAAATTAATACGACTCACTATAG GGtatagcttggaattctaacaatcttgattc‑3’； RT‑RAA下游引物： 5 ’ ‑accggcctgatagatttcagttgaaatatc‑3’； 两种CRIS PR特异性检测的crRNA： Cas13‑Y453F crRNA： 5’ ‑ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc‑3’； Cas12‑Y453F crRNA： 5’ ‑guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau‑3’； RNA荧光探针： 5’ ‑FAM‑mArArΜrGrGrCmAmA rArΜrGrGrCmA ‑BHQ1‑3’； 其中， m代 表2位氧甲基修饰， r 代表核糖核苷酸； DNA荧光探针： 5’ ‑FAM‑TTATTATT‑BHQ1‑3’。 2.根据权利要求1所述的检测筛查新冠病毒Y453F突变的试剂盒， 其特征在于： 还包括 HEPES缓冲液、 MgCl2溶液、 10 ×NEB bμffer2.1缓冲液、 RNase  inhibitor、 T7  RNA  polymerase、 无RNA酶水。 3.一种非诊断目的的检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法， 其特征在于： 包括下列步 骤： 步骤1： 将待检测 样本浸入病毒保存液中， 然后用RNA提取试剂盒进行核酸提取， 得到待 检核酸； 步骤2： 向一容纳有蛋白酶冻干粉的反应管中， 加入41.5μL 的B μffer  A溶液， 2 μL 的RT‑ RAA上游引物， 2 μL的RT ‑RAA下游引物以及2 μL待检核 酸， 然后加2.5 μL的B μffer  B溶液， 盖上 反应管的管盖后进行扩增反应， 得到核酸扩增产物； RT‑RAA上游引物： 5’ ‑GAAATTAATACGACTCACTATAG GGtatagcttggaattctaacaatcttgattc‑3’； RT‑RAA下游引物： 5 ’ ‑accggcctgatagatttcagttgaaatatc‑3’； 步骤3： 配置第一CRISPR反应混合液： 将0.4μL的浓度为1M的HEPES缓冲液、 0.18 μL的浓 度为1M的MgCl2溶液、 0.8μL的浓度为10μM的rNTP  mix、 2μL的浓度为的63.2ng/μL的 LwaCas13a、 1μL的浓度为40Μ/μL的RNase  inhibitor、 0.1μL的浓度为50Μ/μL的T7  RNA  polymerase、 0.5 μL的浓度为10ng/ μL的K 1 crRNA或P1  crRNA、 0.2 μL的浓度为100 μM的RNA荧 光探针和12.82μL的无RNA酶水混合； 配置第二CRISPR反应混合液： 将1μL的浓度为1μM的 LbaCas12a、 1μL的浓度为15ng/μL的B2  crRNA、 2 μL的10 ×NEB b μffer2.1、 0.1μL的浓度为 100 μM的DNA荧 光探针和12.9 μL的无RNA酶水混合； Cas13‑Y453F crRNA: 5’ ‑ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacatcaaaacagguaauuauaauuaccacc‑3’； Cas12‑Y453F crRNA： 5’ ‑guaauuucuacuaaguguagaugauguuuaggaagucuaau‑3’；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115287375 A 2RNA荧光探针： 5’ ‑FAM‑mArArUrGrGrCmAmA rArUrGrGrCmA ‑BHQ1‑3’； 其中， m为2位氧甲基修饰， r为RNA DNA荧光探针： 5’ ‑FAM‑TTATTATT‑BHQ1‑3’； 步骤4： 取2 μL步骤2得到的核酸扩增产物加入到步骤3配置得到的第一CRISPR反应混合 液或第二CRIS PR反应混合液， 37℃孵 育30分钟； 通过 下列方法进行判断： 1、 通过荧 光定量PCR仪 孵育并同时检测荧 光， 或直接水浴最后肉眼观察 荧光变化； 2、 在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器读取FAM通道下的荧光值， 37℃孵育20个循 环， 每个循环间隔1.5分钟， 每次循环结束记录一次荧光信号， 通过最终荧光信号强度判断 Y453F检测结果， 即荧光值大于3000代表Y453F检测阳性， 荧光值小于2000代表Y453F检测阴 性， 若荧光值处于2000 ‑3000之间则重新检测一次， 若荧光值依然为2000 ‑3000则判定Y453F 检测阳性； 若现场无qPCR等荧光读取仪器， 亦可等反应完成后将反应管置于激发波长为 485nm的透射光源 下观察颜色变化确定检测结果； Y453F检测阳性的反应管会发出黄 绿色荧 光， Y453F检测阴性反应管则无荧 光。 4.根据权利要求3所述的非诊断目的的检测筛查新冠病毒Y453F突变的方法， 其特征在 于： b μffer  A溶液配置方法为： 向1L水中加入50mmol的Tris缓冲 液， 100nmol的醋酸钾， 20g 的聚乙二醇粉末和2m mol二硫苏糖醇； B μf ferB溶液为浓度为280mM的醋酸镁溶 液。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115287375 A 3