(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211081701.3 (22)申请日 2022.09.06 (71)申请人 合肥海关技 术中心 地址 230000 安徽省合肥市芜湖路3 67号 (72)发明人 吴琼　宗凯　杜忆南　周静　 田雪枫　王小凤　 (74)专利代理 机构 苏州翔远专利代理事务所 (普通合伙) 32251 专利代理师 王华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测筛查新冠病毒Alpha毒株Δ69-70 突变的方法及试剂盒 (57)摘要 一种检测筛查新冠病毒Alpha毒株Δ69 ‑70 突变的方法及试剂盒， 包括核酸提取得到待检核 酸； 以设计的引物进行扩增反应， 得到核酸扩增 产物； 配置CRISPR反应混合液， 2μL核酸扩增产 物加入到CRISPR反应混合液， 37℃孵育30分钟， 通过荧光读取检测结果。 本发明具有检测速度 快、 准确度高、 成本低以及多场景实时检测的优 点。 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 CN 115261520 A 2022.11.01 CN 115261520 A 1.一种检测筛查新冠病毒Alpha毒株Δ69 ‑70突变的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒 包括： RT‑RAA扩增引物： RT‑RAA上游引物： 5’ ‑GAAATTAATACGACTCACTATAG GGgacaaagttttcagatcctcagttttaca‑3’； RT‑RAA下游引物： 5 ’ ‑ataaacaccatcattaaatggtaggacag‑3’； 一种CRIS PR特异性检测的crRNA： E5 crRNA: 5’ ‑ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacgucccagauauagcauggaaccaaguaa‑3’； RNA荧光探针： 5’ ‑FAM‑mArArUrGrGrCmAmA rArUrGrGrCmA ‑BHQ1‑3’； 其中， m代 表2位氧甲基修饰， r 代表核糖核苷酸。 2.根据权利要求1所述的检测筛查新冠病毒Delta毒株L452R突变和T478K突变的试剂 盒， 其特征在于： 还包括： HEPES缓冲液、 MgCl2溶液、 rNTP  mix、 LwaCas13a、 RNase   inhibitor、 T7  RNA polymerase、 M1  crRNA、 RNA荧 光探针和无RNA酶水。 3.一种非诊断目的的检测筛查新冠病毒Alpha毒株Δ69 ‑70突变的方法， 其特征在于： 包括下列步骤： 步骤1： 将待检测 样本浸入病毒保存液中， 然后用RNA提取试剂盒进行核酸提取， 得到待 检核酸； 步骤2： 向一容纳有蛋白酶冻干粉的反应管中， 加入41.5μL 的buffer  A溶液， 2 μL 的RT‑ RAA上游引物， 2 μL的RT ‑RAA下游引物以及2 μL待检核 酸， 然后加2.5 μL的Buffer  B溶液， 盖上 反应管的管盖后进行扩增反应， 得到核酸扩增产物； RT‑RAA上游引物为： 5’ ‑GAAATTAATACGACTCACTATAG GGgacaaagttttcagatcctcagttttaca‑3’； RT‑RAA下游引物为： 5 ’ ‑ataaacaccatcattaaatggtaggacag‑3’； 步骤3： 配置CRISPR反应混合液： 将0.4μL的浓度为1M的HEPES缓冲液、 0.18 μL的浓度为 1M的MgCl2溶液、 0.8 μL的浓度为10 μM的rNTP  mix、 2 μL的浓度为的63.2 ng/ μL的LwaCas13a、 1 μL的浓度为40U/ μL的RNase  inhibitor、 0.1 μL的浓度为50U/ μL的T7  RNA polymerase、 0.5 μ L的浓度为10ng/ μL的K1  crRNA、 0.2 μL的浓度为100 μM的RNA荧光探针和12.82 μL的无RNA酶 水混合； E5 crRNA: 5’ ‑ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacgucccagauauagcauggaaccaaguaa‑3’； RNA荧光探针： 5’ ‑FAM‑mArArUrGrGrCmAmA rArUrGrGrCmA ‑BHQ1‑3’； 其中， m为2位氧甲基修饰， r为RNA 步骤4： 取2μL步骤2得到 的核酸扩增产物加入到步骤3配置得到 的CRISPR反应混合液， 37℃孵育30分钟； 通过 下列方法进行判断： 1、 通过荧 光定量PCR仪 孵育并同时检测荧 光， 或直接水浴最后肉眼观察 荧光变化； 2、 在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器读取FAM通道下的荧光值， 37℃孵育20个循 环， 每个循环间隔2分钟， 每次循环结束记录一次荧光信号， 通过最终荧光信号强度判断权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261520 A 2Alpha毒株Δ69 ‑70突变检测结果， 即荧光值大于3000代表Alpha毒株Δ69 ‑70突变检测阳 性， 荧光值小于2000代表Alpha毒株Δ69 ‑70突变检测阴性， 若荧光值处于2000 ‑3000之间则 重新检测一次， 若荧光值依然为2000 ‑3000则判定Alpha毒株Δ69 ‑70突变检测阳性； 若现场 无qPCR等荧光读取仪器， 亦可等反应完成后将反应管置于激发波长为485nm 的透射光源下 观察颜色变化确定检测结果； Alpha毒株Δ69 ‑70突变检测阳性的反应管会发出黄绿色荧 光， Alpha毒株Δ 69‑70突变检测阴性反应管则无荧 光。 4.根据权利 要求3所述的非诊断目的的检测筛查新冠病毒Alpha毒株Δ69 ‑70突变的方 法， 其特征在于： b μffer  A溶液配置方法为： 向1L水中加入50mmol的Tri s缓冲液， 100n mol的 醋酸钾， 20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇； B μfferB溶液为浓度为280mM的醋酸镁溶 液。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261520 A 3