(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210699066.9 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 浙江大学医学院附属第一医院 地址 310006 浙江省杭州市上城区庆春路 79号 (72)发明人 崔大伟　吴健　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 赵杭丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测猴痘病毒及其亚型的多重荧光定 量PCR试剂盒 (57)摘要 本发明提供一种检测猴痘病毒及其亚型的 多重荧光定量PCR试剂盒， 所述猴痘病毒包括猴 痘病毒、 猴痘 ‑西非株、 和猴痘 ‑刚果盆地株和 RNase P及其亚型。 本发明分别根据猴痘病毒的 高度保守的核苷酸序列分别设计高特异性的引 物探针， 从而可通过一个PCR反应从血液/分泌物 样本中同时检测出是否有猴痘病毒及其区分其 亚型(猴痘 ‑西非株和猴痘 ‑刚果盆地株)的存在， 较单重荧光定量PCR方法更简便快捷、 成本低， 且 敏感性和特异性及重复性均较好。 对待检病毒进 行全封闭检测、 单管扩增实时定量， 根据病毒感 染的拷贝数， 可有效、 快速地筛查猴痘病毒及其 亚型。 本发 明可应用于猴痘病毒及其亚型的快速 筛查和鉴定及猴痘病毒的流行病学研究。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图5页 CN 115466800 A 2022.12.13 CN 115466800 A 1.一种检测猴痘病毒及其亚型的多重荧光定量PCR试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒包 含定量PCR反应液、 酶混合液、 引物与探针混合液、 标准品、 阳性对照品、 阴性对照品； 其中定 量PCR反应液包含有PCR反应缓冲液、 酶混合液， 引物与探针混合液包含四组引物和相应的 四种不同荧光标记的探针； 荧光定量PCR检测用猴痘病毒、 猴痘 ‑西非株、 猴痘 ‑刚果盆地株 和核糖核酸酶的上游引物和下游引物及相应的特异性探针序列如下： 上游引物h MPV‑F:5’ ‑GTCAGCAGTG GCGATTTTCT‑3’ 下游引物h MPV‑R:5’ ‑TGAACCAGATGGTCCTCTCAATA‑3’ 特异性探针h MPV‑P:5’ ‑FAM‑TAATAAACACCCACGTAAATACAAAACAGA‑BHQ1‑3’ 上游引物h MPV/WA‑F:5’ ‑ATATCACTACG GACATAAACCATTGT‑3’ 下游引物h MPV/WA‑R:5‑ACGTCGATGTCAGA AATAATCAAC‑3’ 特异性探针h MPV/WA‑P:5’ ‑ROX‑TAAGTTCCTGGATCGGATGTCAC CGC‑BHQ2‑3’ 上游引物h MPV/CB‑F:5’ ‑GATATAGGTGTCTTCATAACGCATT‑3’ 下游引物h MPV/CB‑R： 5’ ‑GCGTGAATATCTAAAGATTATGGG‑3’ 特异性探针h MPV/CB‑P:5’ ‑CY5‑TCTCAAATACATGATAG GATAATAGAATGCTAA‑BHQ3‑3’ 上游引物RNase  P‑F:5’ ‑AGATTTGGACCTGCGAGCG ‑3’ 下游引物RNase  P‑R： 5’ ‑GAGCGGCTGTCTC CACAAGT‑3’ 特异性探针RNase  P‑P:5’ ‑VIC‑TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG ‑BHQ1‑3’ 所述标准品包括h MPV、 hMPV/WA、 h MPV/CB和RNase  P的质粒， 其保守区基因序列如下： 猴痘病毒标准品序列为： ATATTTGGTATTACCACATTAATTATATTGTCAGCAGTGGCGATTTTCTGTATTACGTATTATATATGTAATA AACACCCACGTAAATACAAAACAGAGAACAAAGTCTAGATTTTGACTTACATAAATATCTGGGATAATAAAATCTAT CATATTGAGAGGACCATCTGGTTCAGGAAAGACAGCCATAACCAAAAGA 猴痘‑西非株的标准品序列为： GATTAAATATTTTAATAGTATCCATTTTATATCACTACGGACATAAACCATTGTATATTTTTTATGTTTATTA GTGTACACATTTTGGAAGTAAGTTCCTGGATCGGATGTCACCGCAGTAATAATGTTGATTATTTCTGACATCGACGT ATTATATAGT TTTTTAATTCCATATCTTT 猴痘‑刚果盆地株的标准品序列为： TCTTGATACTTTTTCTAGAAAAAAAATTGAATTGATGATATAGGTGTCTTCATAACGCATTATTACGTTAGCA TTCTATTATCCTATCATGTATTTGAGAGTCTTATATGTAGCAAACATGATAACTGCAATACCCATAATCTTTAGATA TTCACGCGTGCTATG GATGGCATTATCCCGCGGT RNase P的标准品序列为： ATGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGG ACTTGTGGAGACAGC CGCTCACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCTATC。 2.根据权利要求1所述的试剂 盒， 其特征在于， 阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙 酯处理水， 阳性对照为猴痘病毒、 猴痘 ‑西非株、 猴痘 ‑刚果盆地株和RNase  P的阳性质粒样 品。 3.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， PCR反应缓冲液管含氯化镁和三磷酸脱 氧核糖核苷酸混合物， 酶混合液含耐热Taq  DNA聚合酶和耐热性RNaseH 。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 引物与探针混合液管为棕色管， 便于避权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115466800 A 2光保存。 5.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述的试剂盒保存于 ‑20℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115466800 A 3