(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210743373.2 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 连云港旋达生物科技有限公司 地址 222199 江苏省连云港市赣榆经济开 发区开发大厦西侧21#楼3 01室 (72)发明人 张璜　但学明　林雪金　高金艳　 田驰　王坤　余嘉明　 (74)专利代理 机构 广州凯东知识产权代理有限 公司 44259 专利代理师 曾志环 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌的实时荧 光定量检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测对虾肝胰腺坏死性 细菌的实时荧光定量检测试剂盒。 该试剂盒包含 一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组和一 组检测对虾属内参基因的引物组， 所述两组引物 组均包括一对特异性引物及对应的TaqMan探针， 试剂盒还包括DNA聚合酶， UNG酶， 2 ×反应缓冲 液， 密封液， 阳性对照参考品和阴性对照参考品。 本发明提供的一管式分装试剂盒可直接从复杂 样品中检测对虾肝胰腺坏死性细菌， 具有特异性 强、 灵敏度高、 实验重复性好、 操作便捷快速的优 点， 不需要昂贵的仪器即可完成检测， 并且内参 基因可以全程监控检测过程， 有效提示假阴性的 现象出现。 可用于对虾肝胰腺坏死性细菌的快 速、 准确检测。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 115216551 A 2022.10.21 CN 115216551 A 1.一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物 组， 其特征在于， 所述引物 组由正向引物F1、 反向引物R1和荧光探针Q1组成， 所述正向引物F1的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 反向引 物R1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 荧 光探针Q1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.根据权利要求1所述的一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物 组， 其特征在于， 所述 荧光探针Q1的5 ’端标记荧 光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 3.一组检测对虾属内参基因的引物 组， 其特征在于， 所述引物组由正向引物F2、 反向引 物R2和荧光探针Q2组成， 所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， 反向引物R2的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 荧 光探针Q2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示。 4.根据权利要求2所述的一组检测对虾属内参基因的引物 组， 其特征在于， 所述荧光探 针Q2的5’端标记荧 光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 5.一种检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权利要求1或2所述的检测对虾肝胰 腺坏死性细菌的引物组， 还 包含权利要求3或4所述的检测对虾属内参基因的引物组。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包含DNA聚合酶， 反转录 酶， UNG酶， 2 ×反应缓冲液， 密封液， 阳性对照参 考品和阴性对照参 考品。 7.根据权利要求6所述 的试剂盒， 其特征在于， 所述DNA聚合酶为Tth  DNA polymerase 和热启动抗体的混合液， UNG酶为尿嘧啶 ‑N‑糖基化酶， 2 ×反应缓冲液是含有dATP、 dCTP、 dGTP和dU TP的2×浓度的反应溶 液， 密封液为矿物油； 所述阳性对照参考品为含有对虾肝胰腺坏死性细菌检测靶标基因与对虾属内参基因 的质粒DNA， 所述阳性对照参 考品为无RNA酶的去离 子水。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的反应体系为： 对虾肝胰腺 坏死性细菌的引物组的正向引物F1、 反向引物R1和荧光探针Q 1引物在反应体系中的终浓度 分别为0.4～ 0.6 μM、 0.4～0.6 μM和0.2～ 0.3 μM； 对虾属内参基因的引物组正向引物F2、 反向 引物R2和荧光探针Q2引物在反应体系中的终浓度分别为0.2～0.4 μM、 0.2～0.4 μM和0.1～ 0.2 μM； 2×反应缓冲液12.5μL， DNA聚合酶2～4U， UNG酶0.3～0.5U， 待检样品2～5μL， 加无 RNA酶的去离 子水至25 μL。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述反应体系的反应条件为50℃5min； 95℃5min； 95℃15s、 6 0℃30s， 45个循环。 10.权利要求5～8任一所述试剂盒在检测对虾肝胰腺坏死性细菌中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115216551 A 2一种检测对虾肝胰 腺坏死性 细菌的实时荧光定量 检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及微生物检测技术领域， 具体地， 涉及一种检测对虾肝胰腺坏死性细菌 荧光定量PCR检测试剂盒。 背景技术 [0002]对虾肝胰腺坏死病(Necr otizing hepato pancreat itis； NHP)是由一种类立克次 体的细菌肝胰腺坏死性细菌(Necrotizin g hepato pancreatitis  bacterium； NHPB)引起 的对虾疾病。 NHPB是一种革兰氏阴性菌， 大小约为0.25m ×0.9jm， 多形态， 专性细胞内寄生。 NHPB是一种感染能力很强的菌种， 宿主包括南美白对虾(Li  to penaeus vannamei)、 白滨 对虾(L.seti  ferus)、 细角滨对虾(L.styli  ros tris)等。 病原的传播方式主要是水平传 播——通过污染的水体、 食物 等。 1990年时， 在美国德州的南美白对虾上首次发现NHP， 此后 在秘鲁、 厄瓜多尔、 委内瑞拉、 巴西、 巴拿马、 哥斯达黎加等国家均有报道。 目前NHP的疫情已 波及西半球的养虾产业， 对养殖虾业者造成严重损失， 其致死率在病征出现的30d内可达 20％～95％。 世界动物卫生组织认为NHP是一种高危的可能在全球爆发的疾病。 通过 16SrRNA分析， 把NHPB归类于蛋白菌的α 亚类， NHPB与斑疹伤寒热立克次氏体和斑点热立克 次氏体有83.5％的相似性。 [0003]在PCR体系中加入扩增内参， 是PCR检测技术标准化的措施之一。 内参是在PC R体系 中加入一段人工合成的DNA序列， 在进行靶标基因的扩增时， 内参基因也进行扩增， 并且由 于靶标基因与内参基因在两个通道各自进行扩增， 两个基因并不会互相 干扰， 所以也不会 对检测结果造成影响。 一般来说内参基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小， 内标定量结果代 表了样本中所含细胞或基因 组数量。 [0004]在PCR目前分子生物 学检测中应用较多的方法是聚合酶链式反应(PC R)， 其检测过 程PCR仪还需要搭配电泳仪和凝胶成像仪使用， 操作步骤多， 耗时长， 且过程易造成气溶胶 污染。 实时荧光定量PCR(Quantitative  Real－time  PCR)是在 常规PCR技术的基础上添加 荧光染料或荧光探针， 利用荧光信号积累实时监测整个P CR进程， 通过标准曲线对 未知浓度 模板进行定量分析的方法。 与普通PCR技术相比， 实时荧光定量PCR技术的TaqMan探针特异 性强， 可进行 单个核苷酸的区分， 同时操作更简便， 检测时间更短。 发明内容 [0005]本发明在现有技术的基础上进行了改进措施， 提供了一种检测对虾肝胰腺坏 死性 细菌的实时荧光定量检测试剂盒。 该试剂盒包含一组检测对虾肝胰腺坏死性细菌的引物组 和一组检测对虾属内参基因的引物组， 所述两组引物组均包括一对特异性引物及对应的 TaqMan探针， 试剂盒还包括DNA聚合 酶， 反转录酶， 2 ×反应缓冲液， 密封液， 阳性对照参考品 和阴性对照参考品。 本发明提供的试剂盒可直接从复杂样品中检测对虾肝胰腺坏死性细 菌， 具有特异性强、 灵敏度高、 实验重复性好和操作便捷快速的优点， 同时设计内参基因引 物作为内部参照， 排除因样品核酸问题或者试剂失效导致的异常结果， 适用于对虾肝胰腺说　明　书 1/8 页 3 CN 115216551 A 3